基于噬菌體基因組學(xué)的HPUFs篩選方法，系統(tǒng)識別噬菌體編碼的有毒產(chǎn)物
耐藥性細(xì)菌分離株的廣泛出現(xiàn)給衛(wèi)生保健帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。研究人員開發(fā)新的有效的抗菌藥以應(yīng)對這一挑戰(zhàn)已作出了重大努力。從不同的微生物中發(fā)現(xiàn)了多種具有抗菌活性的天然化合物。與植物和動物等天然產(chǎn)品來源相比，微生物作為一種來源更容易再生和再生。近年來病毒特別是噬菌體，已成為一種非常有效的抗菌素來源。噬菌體是感染細(xì)菌細(xì)胞的病毒。近年來，人們試圖從噬菌體編碼的抑菌蛋白和溶菌蛋白，如噬菌體編碼的內(nèi)溶酶、VAPGH(病毒相關(guān)的肽聚糖水解酶)、多糖解聚酶和穴蛋白等，開發(fā)出抗菌藥物。許多致病菌對抗生素的耐藥性迅速出現(xiàn)，迫切需要找到新的抗生素替代品。噬菌體，即微生物的病毒，表達(dá)特殊的蛋白質(zhì)來取代它們所感染的細(xì)菌宿主的新陳代謝，其中最著名的是與細(xì)菌裂解有關(guān)的。然而大多數(shù)噬菌體編碼基因產(chǎn)物的功能尚不清楚，噬菌體編輯基因產(chǎn)物代表了功能未知的假想蛋白(HPUFs)。在目前的研究中，研究人員提出了一種基于噬菌體基因組學(xué)的篩選方法來識別噬菌體HPUFs具有抗菌活性，研究的長期目標(biāo)是利用它們尋找未知的線索目的開發(fā)新型抗菌化合物。篩選試驗的基礎(chǔ)是通過抑制細(xì)菌生長時，一個有毒基因的表達(dá)-克隆到一個質(zhì)粒載體。Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)應(yīng)用于病毒的相關(guān)篩選試驗，是首次測試和優(yōu)化使用幾個已知的有毒和無毒基因片段，將其應(yīng)用于94個噬菌體R1-RT的HPUFs篩選，鑒定出4個對大腸桿菌有毒性的HPUFs（功能未知的假想蛋白）。
芬蘭Biosense微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)應(yīng)用
將1ml的M9t培養(yǎng)基中補(bǔ)充了100 ug/mL Amp(w/v)葡萄糖0.2%或0.2%(w/v)樹膠醛醣接種1%洗細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)液將稀釋后的菌液一式三份(300 uL/well)轉(zhuǎn)入到2塊Biosense蜂窩板中。使用Biosense全自動生長曲線分析儀每小時測定一次OD值(600 nm)，持續(xù)此測試16小時。該蜂窩板以較高的振幅和正常的速度不斷地?fù)u動。測量前10秒停止搖晃，立即開始測量。每次測試都經(jīng)過超過三次測量后取平均值，然后直接將全自動生長曲線分析儀獲得的噬菌體顆粒為模板進(jìn)行PCR分析。
實驗結(jié)果：功能闡明的抗菌噬菌體蛋白可以作為靶標(biāo)識別和藥物發(fā)現(xiàn)的有力工具，其研究進(jìn)展十分有限，該研究提出了一種基于抗菌噬菌體蛋白作為靶標(biāo)識別的篩選方法來識別有毒噬菌體HPFU能夠抑制細(xì)菌生長的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)宿主細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)了四種對大腸桿菌有毒性的HPFU。篩選試驗使研究人員能夠系統(tǒng)地從假想的噬菌體蛋白中檢測和識別毒性基因，二這些蛋白并不是目前被業(yè)界作為抗生素開發(fā)的目標(biāo)。這種優(yōu)化的分析方法在原則上對尋找任何噬菌體的殺菌蛋白都是有用的，同時也為理解噬菌體用來取代細(xì)菌宿主的策略開辟了新的可能性。
圖1、已知有毒和無毒基因的混合物轉(zhuǎn)化效率的差異。柱狀圖顯示了兩個不同基因復(fù)制的樣品的CFU/ng值的平均值。
圖2、鍍層試驗篩選94個HPUF基因的相對CFU結(jié)果值。鍍層效率與對照基因g178(A)、g246和g150(B)或g121(C)進(jìn)行歸一化的相對CFU值。
圖3、在阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動子pBAD30控制下表達(dá)噬菌體蛋白的重組大腸桿菌在最小培養(yǎng)基M9t中添加了阿拉伯糖(A)或葡萄糖(B)基因表達(dá)及基因抑制的大腸桿菌生長曲線圖。
圖4、Gp232的92個殘基(245aa-344aa)的預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)。圖像由彩虹N端-C端著色。
圖5、預(yù)測Gp136和Gp137的跨膜螺旋序列。a-α螺旋，b-β螺旋，t-TM螺旋。數(shù)字0-9表示Phyre2對二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的置信度。
總結(jié)：論文主要研究了基于噬菌體基因組學(xué)的HPUFs篩選方法，噬菌體編碼的有毒產(chǎn)物。利用這種方法研究人員應(yīng)用微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)(Biosense)篩選了94個Yersinia噬菌體RNA-RT的HPUFs并鑒定了四種對大腸桿菌有毒的hpuf。利用研究人員提出的此種篩選方法，可以系統(tǒng)地從噬菌體編碼中識別出有毒蛋白HPUFs。研究人員進(jìn)一步提出，這些有毒蛋白反過來可以用來識別新的細(xì)菌藥物發(fā)現(xiàn)的目標(biāo)。應(yīng)用微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)(Biosense)測試阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動子pBAD30控制下表達(dá)不同類型的噬菌體蛋白的重組后大腸桿菌入到的蜂窩板中測試起生長曲線，此生長曲線分析儀主要是采用分光光度/濁度法測量獲得對重組后大腸桿菌的生長曲線，該儀器結(jié)合2塊100孔的微孔板可同時平行測試多個各種菌株樣品的生長曲線，并且所有的過程都是自動化的。
本論文的研究人員全面研究了不同基因蛋白重組表達(dá)的大腸桿菌的生長情況，從而發(fā)現(xiàn)了四種對大腸桿菌有毒性的HPFU蛋白，而這些有毒蛋白反過來可以用來識別新的細(xì)菌藥物發(fā)現(xiàn)的目標(biāo)。此篩選試驗使研究人員能夠系統(tǒng)地從假想的噬菌體蛋白中檢測和識別毒性基因。這種優(yōu)化的分析方法在原則上對尋找任何噬菌體的殺菌蛋白都是有用的，同時也為今后研究人員理解噬菌體用來取代細(xì)菌宿主的策略開辟了新的可能性，這也看出微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)（Biosense）在研究抗病毒蛋白藥物研究方面也能發(fā)揮其重要的應(yīng)用前景，該方法的使用也是今后開發(fā)高通量藥物篩選法中最為關(guān)鍵的技術(shù)提供重要的技術(shù)支持。
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