基于噬菌體基因組學(xué)的HPUFs篩選方法，系統(tǒng)識(shí)別噬菌體編碼的有毒產(chǎn)物
耐藥性細(xì)菌分離株的廣泛出現(xiàn)給衛(wèi)生保健帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。研究人員開(kāi)發(fā)新的有效的抗菌藥以應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)已作出了重大努力。從不同的微生物中發(fā)現(xiàn)了多種具有抗菌活性的天然化合物。與植物和動(dòng)物等天然產(chǎn)品來(lái)源相比，微生物作為一種來(lái)源更容易再生和再生。近年來(lái)病毒特別是噬菌體，已成為一種非常有效的抗菌素來(lái)源。噬菌體是感染細(xì)菌細(xì)胞的病毒。近年來(lái)，人們?cè)噲D從噬菌體編碼的抑菌蛋白和溶菌蛋白，如噬菌體編碼的內(nèi)溶酶、VAPGH(病毒相關(guān)的肽聚糖水解酶)、多糖解聚酶和穴蛋白等，開(kāi)發(fā)出抗菌藥物。許多致病菌對(duì)抗生素的耐藥性迅速出現(xiàn)，迫切需要找到新的抗生素替代品。噬菌體，即微生物的病毒，表達(dá)特殊的蛋白質(zhì)來(lái)取代它們所感染的細(xì)菌宿主的新陳代謝，其中最著名的是與細(xì)菌裂解有關(guān)的。然而大多數(shù)噬菌體編碼基因產(chǎn)物的功能尚不清楚，噬菌體編輯基因產(chǎn)物代表了功能未知的假想蛋白(HPUFs)。在目前的研究中，研究人員提出了一種基于噬菌體基因組學(xué)的篩選方法來(lái)識(shí)別噬菌體HPUFs具有抗菌活性，研究的長(zhǎng)期目標(biāo)是利用它們尋找未知的線索目的開(kāi)發(fā)新型抗菌化合物。篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)是通過(guò)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，一個(gè)有毒基因的表達(dá)-克隆到一個(gè)質(zhì)粒載體。Biosense微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用于病毒的相關(guān)篩選試驗(yàn)，是首次測(cè)試和優(yōu)化使用幾個(gè)已知的有毒和無(wú)毒基因片段，將其應(yīng)用于94個(gè)噬菌體R1-RT的HPUFs篩選，鑒定出4個(gè)對(duì)大腸桿菌有毒性的HPUFs（功能未知的假想蛋白）。
芬蘭Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用
將1ml的M9t培養(yǎng)基中補(bǔ)充了100 ug/mL Amp(w/v)葡萄糖0.2%或0.2%(w/v)樹(shù)膠醛醣接種1%洗細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)液將稀釋后的菌液一式三份(300 uL/well)轉(zhuǎn)入到2塊Biosense蜂窩板中。使用Biosense全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀每小時(shí)測(cè)定一次OD值(600 nm)，持續(xù)此測(cè)試16小時(shí)。該蜂窩板以較高的振幅和正常的速度不斷地?fù)u動(dòng)。測(cè)量前10秒停止搖晃，立即開(kāi)始測(cè)量。每次測(cè)試都經(jīng)過(guò)超過(guò)三次測(cè)量后取平均值，然后直接將全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀獲得的噬菌體顆粒為模板進(jìn)行PCR分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：功能闡明的抗菌噬菌體蛋白可以作為靶標(biāo)識(shí)別和藥物發(fā)現(xiàn)的有力工具，其研究進(jìn)展十分有限，該研究提出了一種基于抗菌噬菌體蛋白作為靶標(biāo)識(shí)別的篩選方法來(lái)識(shí)別有毒噬菌體HPFU能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)宿主細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)了四種對(duì)大腸桿菌有毒性的HPFU。篩選試驗(yàn)使研究人員能夠系統(tǒng)地從假想的噬菌體蛋白中檢測(cè)和識(shí)別毒性基因，二這些蛋白并不是目前被業(yè)界作為抗生素開(kāi)發(fā)的目標(biāo)。這種優(yōu)化的分析方法在原則上對(duì)尋找任何噬菌體的殺菌蛋白都是有用的，同時(shí)也為理解噬菌體用來(lái)取代細(xì)菌宿主的策略開(kāi)辟了新的可能性。
圖1、已知有毒和無(wú)毒基因的混合物轉(zhuǎn)化效率的差異。柱狀圖顯示了兩個(gè)不同基因復(fù)制的樣品的CFU/ng值的平均值。
圖2、鍍層試驗(yàn)篩選94個(gè)HPUF基因的相對(duì)CFU結(jié)果值。鍍層效率與對(duì)照基因g178(A)、g246和g150(B)或g121(C)進(jìn)行歸一化的相對(duì)CFU值。
圖3、在阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子pBAD30控制下表達(dá)噬菌體蛋白的重組大腸桿菌在最小培養(yǎng)基M9t中添加了阿拉伯糖(A)或葡萄糖(B)基因表達(dá)及基因抑制的大腸桿菌生長(zhǎng)曲線圖。
圖4、Gp232的92個(gè)殘基(245aa-344aa)的預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。圖像由彩虹N端-C端著色。
圖5、預(yù)測(cè)Gp136和Gp137的跨膜螺旋序列。a-α螺旋，b-β螺旋，t-TM螺旋。數(shù)字0-9表示Phyre2對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的置信度。
總結(jié)：論文主要研究了基于噬菌體基因組學(xué)的HPUFs篩選方法，噬菌體編碼的有毒產(chǎn)物。利用這種方法研究人員應(yīng)用微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Biosense)篩選了94個(gè)Yersinia噬菌體RNA-RT的HPUFs并鑒定了四種對(duì)大腸桿菌有毒的hpuf。利用研究人員提出的此種篩選方法，可以系統(tǒng)地從噬菌體編碼中識(shí)別出有毒蛋白HPUFs。研究人員進(jìn)一步提出，這些有毒蛋白反過(guò)來(lái)可以用來(lái)識(shí)別新的細(xì)菌藥物發(fā)現(xiàn)的目標(biāo)。應(yīng)用微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Biosense)測(cè)試阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子pBAD30控制下表達(dá)不同類(lèi)型的噬菌體蛋白的重組后大腸桿菌入到的蜂窩板中測(cè)試起生長(zhǎng)曲線，此生長(zhǎng)曲線分析儀主要是采用分光光度/濁度法測(cè)量獲得對(duì)重組后大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線，該儀器結(jié)合2塊100孔的微孔板可同時(shí)平行測(cè)試多個(gè)各種菌株樣品的生長(zhǎng)曲線，并且所有的過(guò)程都是自動(dòng)化的。
本論文的研究人員全面研究了不同基因蛋白重組表達(dá)的大腸桿菌的生長(zhǎng)情況，從而發(fā)現(xiàn)了四種對(duì)大腸桿菌有毒性的HPFU蛋白，而這些有毒蛋白反過(guò)來(lái)可以用來(lái)識(shí)別新的細(xì)菌藥物發(fā)現(xiàn)的目標(biāo)。此篩選試驗(yàn)使研究人員能夠系統(tǒng)地從假想的噬菌體蛋白中檢測(cè)和識(shí)別毒性基因。這種優(yōu)化的分析方法在原則上對(duì)尋找任何噬菌體的殺菌蛋白都是有用的，同時(shí)也為今后研究人員理解噬菌體用來(lái)取代細(xì)菌宿主的策略開(kāi)辟了新的可能性，這也看出微生物生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（Biosense）在研究抗病毒蛋白藥物研究方面也能發(fā)揮其重要的應(yīng)用前景，該方法的使用也是今后開(kāi)發(fā)高通量藥物篩選法中最為關(guān)鍵的技術(shù)提供重要的技術(shù)支持。
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