環(huán)境微生物之生長(zhǎng)和繁殖
1.環(huán)境微生物的生長(zhǎng)和繁殖
(1)環(huán)境微生物的生長(zhǎng)：環(huán)境微生物在適宜的條件下，不斷從周圍環(huán)境中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過酶的作用轉(zhuǎn)化為細(xì)胞物質(zhì)的組分和結(jié)構(gòu)。同化作用的速度超過了異化作用，使個(gè)體細(xì)胞質(zhì)量和體積增加的過程，稱為生長(zhǎng)。
(2)環(huán)境微生物的繁殖：?jiǎn)渭?xì)胞微生物，如細(xì)菌個(gè)體細(xì)胞增大是有限的，體積增大到一定程度就會(huì)分裂，分裂成兩個(gè)大小相似的子細(xì)胞，子細(xì)胞又重復(fù)上述過程，使細(xì)胞數(shù)目增加，稱為繁殖。
單細(xì)胞微生物的生長(zhǎng)實(shí)際是以群體細(xì)胞數(shù)目的增加為標(biāo)志的。霉菌和放線菌等絲狀微生物的生長(zhǎng)主要表現(xiàn)為菌絲的伸長(zhǎng)和分枝，其細(xì)胞數(shù)目的增加并不伴隨著個(gè)體數(shù)目的增多而增加。因此，其生長(zhǎng)通常以菌絲的長(zhǎng)度、體積及重量的增加來衡量，只有通過形成無性孢子或有性孢子使其個(gè)體數(shù)目增加才叫繁殖。
生長(zhǎng)與繁殖的關(guān)系：
個(gè)體生長(zhǎng)→個(gè)體繁殖→群體生長(zhǎng)
群體生長(zhǎng)＝個(gè)體生長(zhǎng)＋個(gè)體繁殖
除特定的目的外，在微生物的研究和應(yīng)用中僅有群體的生長(zhǎng)才有實(shí)際意義，因此，在微生物學(xué)中提到的“生長(zhǎng)”均指群體生長(zhǎng)。
2.環(huán)境微生物生長(zhǎng)的測(cè)定
(1)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定：
a.稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法：
稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法。在大多數(shù)的研究和生產(chǎn)活動(dòng)中，人們往往更需要了解活菌數(shù)的消長(zhǎng)情況。從理論上講,在高度稀釋條件下每一個(gè)活的單細(xì)胞均能繁殖成一個(gè)菌落，因而可用培養(yǎng)的方法使每個(gè)活細(xì)胞生長(zhǎng)成一個(gè)單獨(dú)的菌落，并通過長(zhǎng)出的菌落數(shù)去推算菌懸液中的活菌數(shù)，因此菌落數(shù)就是待測(cè)樣品所含的活菌數(shù)。此法所得到的數(shù)值往往比直接法測(cè)定的數(shù)字小。
稀釋平板計(jì)數(shù)法類型：
(a)涂布法：涂布平板法是將一定體積樣品菌液稀釋后取一定量涂布于平板表面，在最適條件下培養(yǎng)后，從平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘菌液的稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。
(b)傾注法：傾注法是將經(jīng)過滅菌冷卻至45-50℃的瓊脂培養(yǎng)基與稀釋后一定量的樣品在平皿中混勻，凝固后進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)。
稀釋平板計(jì)數(shù)法特點(diǎn)：
這種方法在操作時(shí)，有較高的技術(shù)要求。其中最重要的是應(yīng)使樣品充分混勻，并讓每支移液管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌液。
程序麻煩、費(fèi)工費(fèi)時(shí)，操作者需有熟練的技術(shù)。而且在混合微生物樣品中只能測(cè)定占優(yōu)勢(shì)并能在供試培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的類群。
b.血球計(jì)數(shù)板法：
血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，計(jì)數(shù)是在計(jì)數(shù)室內(nèi)進(jìn)行的，即將一定稀釋度的細(xì)胞懸液加到固定體積的計(jì)數(shù)器小室內(nèi)，在顯微鏡下觀測(cè)小室內(nèi)細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算出樣品中細(xì)胞的濃度，稀釋濃度以記數(shù)室中的小格含有4-5個(gè)細(xì)胞為宜。由于計(jì)數(shù)室的體積是一定(0.1 mL)的，這樣可根據(jù)計(jì)數(shù)出來的數(shù)字，就可算出單位體積菌液內(nèi)的菌體總數(shù)。但一般情況下，要取一定數(shù)量的計(jì)數(shù)室進(jìn)行計(jì)數(shù)，在算出計(jì)數(shù)室的平均菌數(shù)后再次計(jì)算。
血球計(jì)數(shù)板法特點(diǎn)：
測(cè)定簡(jiǎn)便、直接、快速，但測(cè)定的對(duì)象有一定的局限性，只適合于個(gè)體較大的微生物種類，如酵母菌、霉菌的孢子等。此外測(cè)定結(jié)果是微生物個(gè)體的總數(shù)，其中包括死亡的個(gè)體和存活的個(gè)體，要想測(cè)定活菌的個(gè)數(shù)，還須借助其他方法配合。
c.液體稀釋培養(yǎng)法：
對(duì)未知菌樣作連續(xù)10倍系列稀釋。根據(jù)估計(jì)數(shù)，從最適宜的3個(gè)連續(xù)10倍稀釋液中各取一定量的試樣，接種到裝有培養(yǎng)液的試管中。經(jīng)培養(yǎng)后，記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查MPN(Mostprobable number)表，再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)就可算出其中的活菌量。該法常用于食品中微生物的檢測(cè)，如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。
d.比濁法：
在細(xì)菌培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中，由于細(xì)胞數(shù)量增加，會(huì)引起培養(yǎng)物混濁度增高，使光線透過量降低。在一定濃度范圍內(nèi)，懸液中細(xì)胞的數(shù)量與透光量成反比，與光密度成正比。比濁管是用不同濃度的BaCl2與稀H2SO4配制成的10支試管，其中形成的BaSO4有10個(gè)梯度，分別代表10個(gè)相對(duì)的細(xì)菌濃度(預(yù)先用相應(yīng)的細(xì)菌測(cè)定)。某一未知濃度的菌液只需在透射光下用肉眼與某一比濁管進(jìn)行比較，若兩者透光度相當(dāng)，即可目測(cè)出該菌液的大致濃度。若要作精確測(cè)定可用分光光度計(jì)在可見光的450-650 nm波段內(nèi)測(cè)定。
(2)細(xì)胞生物量的測(cè)定：
a.稱干重法：
即測(cè)定單位體積的培養(yǎng)物中細(xì)菌的干質(zhì)量。該法要求培養(yǎng)物中無菌體外的固體顆粒，對(duì)單細(xì)胞及多細(xì)胞均適用。可用離心法或過濾法測(cè)定，一般菌體干重為濕重的10-20%。
在離心法中，將待測(cè)培養(yǎng)液放入離心管中，用清水離心洗滌1-5次后干燥。干燥溫度可采用105℃、100℃或紅外線烘干，也可在較低的溫度(80℃或40℃)下進(jìn)行真空干燥后稱重。
在過濾法中，絲狀真菌可用濾紙過濾，而細(xì)菌則可用醋酸纖維膜等濾膜進(jìn)行過濾。過濾后，細(xì)胞可用少量水洗滌，然后在40℃下真空干燥后稱干重。這種方法較適合于絲狀微生物的生長(zhǎng)量的測(cè)定。
b.總氮量測(cè)定：
大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為其干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)其含氮量再乘以6.25，即可測(cè)得粗蛋白的含量(其中包括雜環(huán)氮和氧化型氮)，然后再換算成生物量。其中蛋白質(zhì)總量＝含氮量×6.25。細(xì)胞總量≈蛋白質(zhì)總量×1.54。
c.DNA含量測(cè)定：
DNA在各種細(xì)胞內(nèi)的含量最為穩(wěn)定，不會(huì)因加入營(yíng)養(yǎng)物而發(fā)生變化。盡管DNA測(cè)定方法較繁瑣、費(fèi)用也高，但在某些特殊情況下，DNA測(cè)定可發(fā)揮其特殊的的優(yōu)勢(shì)，如固定化載體內(nèi)的微生物含量一般無法用直接法測(cè)定，但可將載體粉碎后測(cè)定DNA來估算微生物的細(xì)胞數(shù)。
核酸DNA是微生物的重要遺傳物質(zhì)每個(gè)細(xì)菌的DNA含量相當(dāng)恒定平均為8.4×10-5ng。
d.代謝活動(dòng)法：
從細(xì)胞代謝產(chǎn)物來估算，在有氧發(fā)酵中，CO2是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，它與微生物生長(zhǎng)密切相關(guān)。在全自動(dòng)發(fā)酵罐中大多采用紅外線氣體分析儀來測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)生的CO2量，進(jìn)而估算出微生物的生長(zhǎng)量。
3.環(huán)境微生物的生長(zhǎng)規(guī)律
(1)微生物的生長(zhǎng)曲線：
將少量單細(xì)胞微生物純菌種接種到新鮮的液體培養(yǎng)基中，在最適條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中定時(shí)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，以細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，可畫出一條有規(guī)律的曲線，這就是微生物的生長(zhǎng)曲線。生長(zhǎng)曲線嚴(yán)格說應(yīng)稱為繁殖曲線，因?yàn)閱渭?xì)胞微生物，如細(xì)菌等均以細(xì)菌數(shù)增加作為生長(zhǎng)指標(biāo)。這條曲線代表了細(xì)菌在新的適宜環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖至衰老死亡的動(dòng)態(tài)變化。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖速度的不同可將其分為四個(gè)時(shí)期：適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰亡期。
a.延滯期：又叫適應(yīng)期，是微生物接種到新的培養(yǎng)基中，一般不立即進(jìn)行繁殖，生長(zhǎng)速率常數(shù)為零，需經(jīng)一段時(shí)間自身調(diào)整，誘導(dǎo)合成必要的酶、輔酶或合成某些中間代謝產(chǎn)物。此時(shí)，細(xì)胞重量增加，體積增大，但不分裂繁殖，細(xì)胞長(zhǎng)軸伸長(zhǎng)(如巨大芽孢桿菌的長(zhǎng)度由3.4μm增長(zhǎng)到9.1-19.8μm)，細(xì)胞質(zhì)均勻，DNA含量高。細(xì)胞內(nèi)RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)體嗜堿性。對(duì)外界不良條件的反應(yīng)敏感。
在發(fā)酵工業(yè)，為提高生產(chǎn)效率，除了選擇合適的菌種外，常要采取措施縮短延滯期。其主要方法有：①以對(duì)數(shù)期的種子接種，因?qū)?shù)期的菌種生長(zhǎng)代謝旺盛，繁殖力強(qiáng)，則子代培養(yǎng)期的適應(yīng)期就短。②適當(dāng)增加接種量。生產(chǎn)上接種量的多少是影響延滯期的的一個(gè)重要因素。接種量大，延滯期短，反之則長(zhǎng)。一般采用3%-8%接種量，根據(jù)不同的微生物及生產(chǎn)具體情況而定，一般不超過1/10接種量。③培養(yǎng)基成分。現(xiàn)在發(fā)酵生產(chǎn)中，常用發(fā)酵培養(yǎng)的成分與種子培養(yǎng)基的成分相近。因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基中要比生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)單調(diào)的合成培養(yǎng)基中延滯期短。
b.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：又稱指數(shù)生長(zhǎng)期，是在生長(zhǎng)曲線中，緊接著延滯期后的一段時(shí)期。此時(shí)的菌體通過對(duì)新的環(huán)境適應(yīng)后，細(xì)胞代謝活性最強(qiáng)，生長(zhǎng)旺盛，分裂速度幾乎按幾何級(jí)數(shù)增加，群體形態(tài)與生理特征最一致，抵抗不良環(huán)境的能力最強(qiáng)。其生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)為一條近乎上升的直線。
在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每一種微生物的世代時(shí)間(細(xì)胞每分裂一次所需要的時(shí)間)是一定的，這是微生物菌種的一個(gè)重要特征。以分裂增殖時(shí)間t除以分裂增殖代數(shù)(n)，即可求出每增一代所需的時(shí)間(G)。
在一定時(shí)間內(nèi)，菌體細(xì)胞分裂次數(shù)愈多，世代時(shí)間越短，分裂速度越快。不同微生物菌體其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的世代時(shí)間不同，同一種微生物在不同培養(yǎng)基組分和不同環(huán)境條件下，如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值、營(yíng)養(yǎng)物性質(zhì)等，世代時(shí)間也不同。但每種微生物在一定條件下，其世代時(shí)間是相對(duì)穩(wěn)定的。多數(shù)種類世代時(shí)間為20-30 min。
c.穩(wěn)定期：又稱最高生長(zhǎng)期。在一定溶劑的培養(yǎng)基中，由于微生物經(jīng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的旺盛生長(zhǎng)后，某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，有害代謝產(chǎn)物積累以及pH值、氧化還原電位、無機(jī)離子濃度等變化，限制菌體繼續(xù)高速度增殖，初期細(xì)菌分裂間隔的時(shí)間開始延長(zhǎng)，曲線上升逐漸緩慢。隨后，部分細(xì)胞停止分裂，少數(shù)細(xì)胞開始死亡，使新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞死亡數(shù)幾乎相等，處于動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)菌數(shù)達(dá)到最高水平，接著死亡數(shù)超過新增殖數(shù)，曲線出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這時(shí)，細(xì)胞內(nèi)開始積累貯藏物質(zhì)如肝糖原、異染顆粒、脂肪滴等，大多數(shù)芽孢細(xì)菌在此時(shí)形成芽孢。同時(shí)，發(fā)酵液中細(xì)菌的產(chǎn)物的積累逐漸增多，是發(fā)酵目的產(chǎn)物生成的重要階段(如抗生素等)。
d.衰亡期。穩(wěn)定期后，環(huán)境變得不適合于細(xì)菌的生長(zhǎng)，細(xì)胞生活力衰退，死亡率增加，以致細(xì)胞死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，細(xì)菌總數(shù)急劇下降，這時(shí)期稱為衰亡期。這個(gè)時(shí)期細(xì)胞常出現(xiàn)多形態(tài)等畸形以及液泡，有許多菌在衰亡期后期常產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，使工業(yè)生產(chǎn)中后處理過濾困難。產(chǎn)生衰亡期的原因主要是外界環(huán)境對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)菌越來越不利，從而引起細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，導(dǎo)致菌體死亡。
(2)細(xì)菌的個(gè)體生長(zhǎng)與同步生長(zhǎng)：
在分批培養(yǎng)中，細(xì)菌群體以一定速率生長(zhǎng)，但所有細(xì)胞并非同時(shí)進(jìn)行分裂，即使培養(yǎng)中的細(xì)胞處于同一生長(zhǎng)階段，它們的生理狀態(tài)和代謝活動(dòng)也不完全一樣。要研究每個(gè)細(xì)胞所發(fā)生的變化是很困難的。為了解決這一問題，就必須設(shè)法使微生物群體處于同一發(fā)育階段，使群體和個(gè)體行為變得一致，所有的細(xì)胞都能同時(shí)分裂，因而發(fā)展了單細(xì)胞的同步培養(yǎng)技術(shù)。即設(shè)法使群體中的所有細(xì)胞盡可能都處于同樣細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂周期中，然后分析此群體的各種生物化學(xué)特征，從而了解單個(gè)細(xì)胞所發(fā)生的變化。
獲得細(xì)菌同步培養(yǎng)的方法主要有兩類，其一是通過調(diào)整環(huán)境條件來誘導(dǎo)同步性，如通過變換溫度、光線或?qū)μ幱诜€(wěn)定期的培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基等來誘導(dǎo)同步；其二是選擇法(又稱機(jī)械法)，它是利用物理方法從不同步的細(xì)菌群體中選擇出同步的群體，一般可用過濾分離法或梯度離心法來達(dá)到。在這兩種方法中，由于誘導(dǎo)法可能導(dǎo)致與正常細(xì)胞循環(huán)周期不同的周期變化，所以不及選擇法好，這在生理學(xué)研究中尤其明顯。
在選擇法中，有代表性的是硝酸纖維素薄膜法。其大致過程為：將菌液通過裝有硝酸纖維素濾膜的過濾器，由于細(xì)菌與濾膜帶有不同的電荷，所以處于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)菌均附著在膜上；將膜翻轉(zhuǎn)，再用新鮮的培養(yǎng)液濾過培養(yǎng)；附著在膜上的細(xì)菌開始分裂，分裂的子細(xì)胞不能與薄膜直接接觸，由于菌體自身重量，加上其附帶的培養(yǎng)液重量，使菌體下落到收集器內(nèi)；收集器在短時(shí)間內(nèi)獲得的細(xì)菌都處于同一分裂階段的新細(xì)胞，用這些細(xì)胞接種培養(yǎng)，于是就獲得了同步生長(zhǎng)。
(3)微生物連續(xù)培養(yǎng)：
連續(xù)培養(yǎng)又叫開放培養(yǎng)，是相對(duì)分批培養(yǎng)或密閉培養(yǎng)而言的。在分批培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是一次性加入，不再補(bǔ)充，隨著微生物的生長(zhǎng)繁殖活躍，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，有害代謝產(chǎn)物不斷積累，細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不可能長(zhǎng)時(shí)維持。連續(xù)培養(yǎng)是在研究生長(zhǎng)曲線的基礎(chǔ)上，認(rèn)識(shí)到穩(wěn)定期到來的原因，采取在培養(yǎng)器中不斷補(bǔ)充新鮮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并攪拌均勻，同時(shí)不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物(包括菌體和代謝產(chǎn)物)。這樣，培養(yǎng)物就達(dá)動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物可長(zhǎng)期保持在對(duì)數(shù)期的平衡生長(zhǎng)狀態(tài)和穩(wěn)定的生長(zhǎng)速率上。此法是目前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向。
微生物連續(xù)培養(yǎng)類型：
a.恒濁連續(xù)培養(yǎng)：用濁度計(jì)來檢測(cè)培養(yǎng)液中菌液濃度，使培養(yǎng)液中細(xì)菌的濃度恒定的培養(yǎng)方法稱為恒濁培養(yǎng)。所涉及的培養(yǎng)和控制裝置稱為恒濁器。當(dāng)恒濁器中濁度超過預(yù)期數(shù)值時(shí)，可促使培養(yǎng)液流速加快，使?jié)岫认陆担粷岫扔?jì)低于預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速減慢，使?jié)岫仍黾印＿@種方法可自動(dòng)地進(jìn)行控制，使培養(yǎng)物維持一定的濁度。濁度下降，表明體系中有豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，濁度的改變是培養(yǎng)物中的菌體數(shù)量的標(biāo)志。
在恒濁器中通過控制培養(yǎng)液的流速，從而獲得密度高、生長(zhǎng)速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)液。微生物在恒濁器中，始終能以最高生長(zhǎng)速率進(jìn)行生長(zhǎng)，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度。在生產(chǎn)實(shí)踐上，為了獲得大量菌體或與菌體生長(zhǎng)相平行的某些代謝產(chǎn)物如乳酸、乙醇時(shí)，可采用恒濁法。
b.恒化連續(xù)培養(yǎng)：控制恒定的流速，使培養(yǎng)器內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度基本恒定，使細(xì)菌生長(zhǎng)所消耗的物質(zhì)及時(shí)得到補(bǔ)充，從而維持細(xì)菌恒定的生長(zhǎng)速率的一種連續(xù)培養(yǎng)方法稱為恒化培養(yǎng)。常用于實(shí)驗(yàn)室研究。
當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物濃度偏高時(shí)，并不影響微生物的生長(zhǎng)速度，而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物濃度較低時(shí)，則影響菌體生長(zhǎng)速度，且在一定范圍內(nèi)生長(zhǎng)速率與營(yíng)養(yǎng)物濃度成正比關(guān)系。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度的確定往往是將培養(yǎng)基中的一種微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物控制在較低的濃度下，作為限制生長(zhǎng)的因子(如氮源、碳源、無機(jī)鹽或其他生長(zhǎng)因子等)，其他營(yíng)養(yǎng)物是過量的。通過控制生長(zhǎng)因子的濃度，來保持菌體恒定的生長(zhǎng)速率。
連續(xù)培養(yǎng)如用于發(fā)酵工業(yè)中，就稱為連續(xù)發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵相比有許多優(yōu)點(diǎn)：①高效。它簡(jiǎn)化了裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等許多單元操作，從而減少了非生產(chǎn)時(shí)間和提高了設(shè)備的利用率；②自控。便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；③產(chǎn)品的質(zhì)量較穩(wěn)定；④節(jié)約了大量動(dòng)力、人力、水和蒸氣，且使水、汽、電的負(fù)荷均勻合理。
連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)發(fā)酵也有一定的缺點(diǎn)。最主要的缺點(diǎn)是菌種易于退化，處于長(zhǎng)期高速繁殖下的微生物，即使其自發(fā)突變率極低，也無法避免變異的發(fā)生，尤其易發(fā)生比原生產(chǎn)菌株生長(zhǎng)速率更高、營(yíng)養(yǎng)要求低和代謝產(chǎn)物少的負(fù)變類型。其次，易受雜菌污染，在長(zhǎng)期運(yùn)轉(zhuǎn)中，要保持各種設(shè)備無滲漏，尤其是通氣系統(tǒng)不出任何故障，是極其困難的。因此，連續(xù)培養(yǎng)是有時(shí)間限制的，一般可達(dá)數(shù)月至一到兩年。此外，在連續(xù)培養(yǎng)中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率一般也低于分批培養(yǎng)。
4.影響環(huán)境微生物生長(zhǎng)的因素
影響環(huán)境微生物生長(zhǎng)的外界因素很多，除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還有許多物理、化學(xué)因素。當(dāng)環(huán)境條件改變?cè)谝欢ㄏ薅葍?nèi)，可引起環(huán)境微生物形態(tài)、生理、生長(zhǎng)、繁殖等特征的改變；當(dāng)環(huán)境條件的變化超過一定極限時(shí)，則導(dǎo)致環(huán)境微生物死亡。
影響環(huán)境微生物生長(zhǎng)的環(huán)境因素主要是溫度、水、pH、氧氣等。
(1)溫度的影響
溫度是影響環(huán)境微生物生長(zhǎng)繁殖最重要的因素之一。在一定溫度范圍內(nèi)，機(jī)體的代謝活動(dòng)與生長(zhǎng)繁殖隨著溫度的上升而增加，當(dāng)溫度上升到一定程度，開始對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響，若再繼續(xù)升高，則細(xì)胞功能急劇下降以至死亡。與其他生物一樣，任何環(huán)境微生物的生長(zhǎng)溫度盡管有高有低，但總有最低生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度，這就是生長(zhǎng)溫度的三個(gè)基本點(diǎn)。
最低生長(zhǎng)溫度是指環(huán)境微生物能進(jìn)行繁殖的最低溫度界限。處于這種溫度條件下的環(huán)境微生物生長(zhǎng)速率很低，若低于此溫度則生長(zhǎng)完全停止。
最適生長(zhǎng)溫度是指環(huán)境微生物分裂的世代時(shí)間最短或生長(zhǎng)速率最高時(shí)的培養(yǎng)溫度。但是，同一環(huán)境微生物，不同的生理生化過程有著不同的最適溫度，即最適生長(zhǎng)溫度并不等于生長(zhǎng)量最高時(shí)的培養(yǎng)溫度，也不等于發(fā)酵速度最高時(shí)的培養(yǎng)溫度或累積代謝產(chǎn)物量最高時(shí)的培養(yǎng)溫度。因此，生產(chǎn)上要根據(jù)微生物不同生理代謝過程溫度的特點(diǎn)，采用分段式變溫培養(yǎng)或發(fā)酵。如嗜熱鏈球菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適發(fā)酵溫度為47℃，累積產(chǎn)物的最適溫度為37℃。
最高生長(zhǎng)溫度是指微生物生長(zhǎng)繁殖的最高溫度界限。在此溫度下，微生物細(xì)胞易于衰老和死亡。微生物所能適應(yīng)的最高生長(zhǎng)溫度與其細(xì)胞內(nèi)酶的性質(zhì)有關(guān)。如細(xì)胞色素氧化酶以及各種脫氫酶的最低破壞溫度常與該菌的最高生長(zhǎng)溫度有關(guān)。
環(huán)境微生物的溫型：
環(huán)境微生物按其生長(zhǎng)溫度范圍可分為低溫型微生物、中溫型微生物和高溫型微生物三類。
a.低溫型微生物，又稱嗜冷微生物。可在較低的溫度下生長(zhǎng)。常分布在地球兩極地區(qū)的水域和土壤中。常見的產(chǎn)堿桿菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬等常使冷藏食品腐敗變質(zhì)。有些肉類上的霉菌在負(fù)10℃仍能生長(zhǎng)，如芽枝霉；熒光極毛菌可在負(fù)4℃生長(zhǎng)，并造成冷凍食品腐敗變質(zhì)。
低溫也能抑制微生物的生長(zhǎng)。在0℃以下，菌體內(nèi)的水分凍結(jié)，生化反應(yīng)無法進(jìn)行而停止生長(zhǎng)。有些環(huán)境微生物在冰點(diǎn)下就會(huì)死亡，主要原因是細(xì)胞內(nèi)水分變成了冰晶，造成細(xì)胞脫水或細(xì)胞膜的物理?yè)p傷。因此，生產(chǎn)上常用低溫保藏食品，各種食品的保藏溫度不同，分為寒冷溫度、冷藏溫度和凍藏溫度。
寒冷溫度：指在室溫(14-15℃)和冷藏溫度之間的溫度。嗜冷微生物在這一溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)較緩慢，保藏食品的有效期較短，一般僅適宜于保藏果蔬食品。
冷藏溫度：指在0-5℃之間的溫度。在這一溫度范圍內(nèi)，微生物的代謝活動(dòng)已顯著減弱，可用于儲(chǔ)存果蔬、魚肉、禽蛋、乳類等食品。
凍藏溫度：指低于0℃以下的溫度。在-18℃以下的溫度幾乎阻止所有環(huán)境微生物的生長(zhǎng)。在凍藏溫度下可較長(zhǎng)期地保藏食品。
b.中溫型微生物。絕大多數(shù)環(huán)境微生物屬于這一類。最適生長(zhǎng)溫度在20-40℃之間，最低生長(zhǎng)溫度10-20℃，最高生長(zhǎng)溫度40-45℃。它們又可分為嗜室溫和嗜體溫性微生物。嗜體溫性微生物多為人及溫血?jiǎng)游锏牟≡鼈兩L(zhǎng)的極限溫度范圍在10-45℃，最適生長(zhǎng)溫度與其宿主體溫相近，在35-40℃之間，人體寄生菌為37℃左右。引起人和動(dòng)物疾病的病原微生物、發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用的微生物菌種及導(dǎo)致食品原料和成品腐敗變質(zhì)的環(huán)境微生物均屬于這一類群的微生物，如大腸桿菌和酵母菌。因此，它與食品工業(yè)的關(guān)系最為密切。
c.高溫型微生物。它們適于在45-50℃以上的溫度中生長(zhǎng)，在自然界中的分布僅局限于某些地區(qū)，如溫泉、日照充足的土壤表層、堆肥、發(fā)酵飼料等腐爛有機(jī)物中，如堆肥中溫度可達(dá)60-70℃。能在55-70℃中生長(zhǎng)的微生物有芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、高溫放線菌屬、甲烷桿菌屬等；溫泉中的細(xì)菌；其次是鏈球菌屬和乳桿菌屬。有的可在近于100℃的高溫中生長(zhǎng)。這類高溫型的微生物，給罐頭工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)等帶來了一定難度。
高溫型微生物耐熱機(jī)理可能是菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶比中溫型的微生物更能抗熱，尤其蛋白質(zhì)對(duì)熱更穩(wěn)定；同時(shí)高溫型微生物的蛋白質(zhì)合成機(jī)構(gòu)—核糖體和其他成分對(duì)高溫抗性也較大；細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量高，它比不飽和脂肪酸可以形成更強(qiáng)的疏水鍵，因此可保持在高溫下的穩(wěn)定性并具正常功能。
(2)水分和滲透壓的影響
水是環(huán)境微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶劑，水分對(duì)維持環(huán)境微生物的正常生命活動(dòng)是必不可少的。水在環(huán)境微生物細(xì)胞中有兩種存在形式：結(jié)合水和游離水。結(jié)合水與溶質(zhì)或其他分子結(jié)合在一起，很難加以利用。游離水則可被環(huán)境微生物利用。
水分活度是用來表示環(huán)境微生物在天然環(huán)境和人為環(huán)境中實(shí)際利用游離水的含量，即在相同條件下，密閉容器內(nèi)該溶液的蒸汽壓(p)與純水蒸汽壓(p0)之比，即Aw=p/p0。純水的Aw=1，各種環(huán)境微生物在Aw=0.63-0.99的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。
環(huán)境微生物必須在較高的Aw環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，Aw太低時(shí)，微生物生長(zhǎng)遲緩、代謝停止，甚至死亡。但不同的環(huán)境微生物生長(zhǎng)的最適Aw不同，即最低的水分活性區(qū)域不同。
干燥環(huán)境(Aw＜0.60-0.70)條件下，多數(shù)環(huán)境微生物代謝停止，處于休眠狀態(tài)，嚴(yán)重時(shí)引起脫水，蛋白質(zhì)變性，甚至死亡，這是干燥條件能保存食品和物品，防止腐敗和霉變的原理，同時(shí)，這也是環(huán)境微生物菌體保藏技術(shù)的依據(jù)之一。不同環(huán)境微生物在不同生長(zhǎng)期對(duì)干燥的抵抗能力不同。酵母菌失水后可保存數(shù)月；產(chǎn)莢膜的菌比不產(chǎn)莢膜的菌對(duì)干燥的抵抗力強(qiáng)；小型、厚壁細(xì)胞的微生物比長(zhǎng)型、薄壁細(xì)胞的微生物抗干燥能力強(qiáng)；芽孢、孢子抗干燥的能力比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞強(qiáng)。
影響環(huán)境微生物對(duì)干燥抵抗力的因素較多，干燥時(shí)溫度升高，微生物容易死亡，環(huán)境微生物在低溫下干燥時(shí)，抵抗力強(qiáng)，故干燥后存活的環(huán)境微生物若處于低溫下可用于保藏菌種；干燥的速度快，環(huán)境微生物抵抗力強(qiáng)，緩慢干燥時(shí)環(huán)境微生物易死亡；環(huán)境微生物在真空干燥時(shí)，在加保護(hù)劑(血清、血漿、肉湯、蛋白胨、脫脂牛乳)的菌懸液中，分裝在安瓿內(nèi)，低溫下可保持長(zhǎng)達(dá)數(shù)年甚至10 a的生命力。
細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度與胞外溶質(zhì)濃度(如0.85%NaCl溶液)相等時(shí)的狀態(tài)，稱為等滲狀態(tài)。
溶液的溶質(zhì)濃度高于胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，則稱為高滲溶液，能在此環(huán)境中生長(zhǎng)的環(huán)境微生物，稱為耐高滲微生物。當(dāng)溶質(zhì)濃度很高時(shí)，細(xì)胞就會(huì)脫水，發(fā)生質(zhì)壁分離，甚至死亡。鹽漬(5%-30%食鹽)和蜜餞(30％-80%糖)可抑制或殺死環(huán)境微生物，這是一些常用食品保存法的依據(jù)。
若溶液的溶質(zhì)濃度低于胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，則稱為低滲溶液，環(huán)境微生物在低滲溶液中，水分向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，細(xì)胞膨脹，甚至脹破。這是低滲破碎細(xì)胞法(通常將洗凈并離心得到的菌體投入80倍預(yù)冷的(5×10)-4 M/LMgCl2溶液中，劇烈攪拌，使細(xì)胞內(nèi)溶物釋放到溶液中)的原理。該方法對(duì)細(xì)胞壁較牢固的革蘭氏陽(yáng)性菌不適用。
(3)pH的影響
環(huán)境微生物生長(zhǎng)的pH值范圍極廣，一般在pH 2-8間，少數(shù)種類還可超出該范圍。不同的環(huán)境微生物均有其最適生長(zhǎng)pH值和一定的pH范圍，即最高、最適與最低三個(gè)數(shù)值，在最適pH范圍內(nèi)環(huán)境微生物生長(zhǎng)繁殖速度快，在最低或最高pH值的環(huán)境中，環(huán)境微生物雖能生存和生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速率很緩慢且易死亡。一般霉菌能適應(yīng)pH值范圍最大，酵母菌適應(yīng)的范圍較小，細(xì)菌最小。
霉菌和酵母菌生長(zhǎng)最適pH值都在5.0-6.0，而細(xì)菌的生長(zhǎng)最適pH值在7.0左右。一些最適生長(zhǎng)pH值偏于堿性范圍內(nèi)微生物，有的是嗜堿性，稱嗜堿性微生物，如硝化菌、尿素分解菌、根瘤菌和放線菌等。有的不一定要在堿性條件下生活，但能耐較堿的條件，稱耐堿微生物，如若干鏈霉菌等。生長(zhǎng)pH值偏于酸性范圍內(nèi)的微生物也有兩類，一類是嗜酸微生物，如硫桿菌屬等，另一類是耐酸微生物，如乳酸桿菌、醋酸桿菌、許多腸桿菌和假單胞菌等。
同一種微生物在其不同的生長(zhǎng)階段和不同的生理生化過程中，對(duì)pH值的要求也不同。在發(fā)酵工業(yè)中，控制pH值尤其重要，如Aspergillus niger在pH 2-2.5時(shí)有利于合成檸檬酸，當(dāng)在pH 2.5-6.5時(shí)以菌體生長(zhǎng)為主，而在pH 7.0時(shí)，則以合成草酸為主。丙酮丁醇梭菌在pH 5.5-7.0時(shí)以菌體生長(zhǎng)為主，而在pH 4.3-5.3時(shí)才進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵。
環(huán)境微生物在其代謝過程中，細(xì)胞內(nèi)的pH值相當(dāng)穩(wěn)定，一般均接近中性，以保護(hù)核酸穩(wěn)定和酶活性；但環(huán)境微生物會(huì)改變環(huán)境的酸堿度，使培養(yǎng)基原始pH值變化。發(fā)生的原因：糖類和脂肪代謝產(chǎn)酸、蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)堿、其他物質(zhì)代謝產(chǎn)生酸堿。一般隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基會(huì)變得較酸，當(dāng)碳氮比例高的培養(yǎng)基，如培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后其pH值常會(huì)明顯下降，而碳氮比例低的培養(yǎng)基，如培養(yǎng)一般細(xì)菌的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，其pH值常會(huì)明顯上升。
(4)氧的影響
氧氣對(duì)環(huán)境微生物的生命活動(dòng)有著重要影響。按照微生物與氧氣的關(guān)系，可把它們分成好氧菌和厭氧菌兩大類。好氧菌中又分為專性好氧、兼性厭氧和微好氧菌；厭氧菌分為專性厭氧菌、耐氧菌。
a.專性好氧菌。要求必須在有分子氧的條件下才能生長(zhǎng)，有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細(xì)胞有超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶，絕大多數(shù)真菌和許多細(xì)菌均是專性好氧菌，如米曲霉、醋酸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌等。
b.微好氧菌。只能在較低的氧分壓(0.01-0.03×101k Pa，正常大氣壓為0.2×101kPa)下才能正常生長(zhǎng)的微生物。也通過呼吸鏈以氧為最終氫受體而產(chǎn)能。如霍亂弧菌、一些氫單胞菌、擬桿菌屬和發(fā)酵單胞菌屬。
c.兼性厭氧菌。在有氧或無氧條件下均能生長(zhǎng)，但有氧的情況下生長(zhǎng)得更好；有氧時(shí)進(jìn)行好氧呼吸產(chǎn)能，無氧時(shí)進(jìn)行發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能；細(xì)胞含SOD和過氧化氫酶。許多酵母菌和許多細(xì)菌都是兼性厭氧菌。如釀酒酵母、大腸桿菌和普通變形桿菌等。
d.耐氧菌。一類可在分子氧存在時(shí)進(jìn)行厭氧呼吸的厭氧菌，即它們的生長(zhǎng)不需要氧，但分子氧存在對(duì)它也無毒害。它們不具有呼吸鏈，僅依靠專性發(fā)酵獲得能量。細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶，但沒有過氧化氫酶。一般乳酸菌多數(shù)是耐氧菌，如乳鏈球菌、乳酸乳桿菌、腸膜明串珠菌和糞鏈球菌等，乳酸菌以外的耐氧菌如雷氏丁酸桿菌。
e.專性厭氧菌。分子氧存在對(duì)它們有毒，即使是短期接觸空氣也會(huì)抑制其生長(zhǎng)甚至死亡；在空氣或含10%CO2的空氣中，它們?cè)诠腆w或半固體培養(yǎng)基的表面上不能生長(zhǎng)，只能在深層無氧或低氧化還原勢(shì)的環(huán)境下才能生長(zhǎng)；其生命活動(dòng)所需能量是通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵等提供；細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。常見的厭氧菌有罐頭工業(yè)的腐敗菌如肉毒梭狀芽孢桿菌、嗜熱梭狀芽孢桿菌、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬及各種光和細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌等。
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