根際細(xì)菌菌株可提高辣、及花生種子發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)
3結(jié)果與分析
3.1 3株茶樹(shù)根際細(xì)菌浸種對(duì)辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響
利用從茶樹(shù)根際分離、篩選到的3株細(xì)菌菌株GD 3、KKS-6-N 1及P 5對(duì)辣椒進(jìn)行浸種試驗(yàn)，萌發(fā)后于盆栽條件下繼續(xù)生長(zhǎng)30 d后測(cè)定幼苗的相應(yīng)生長(zhǎng)指標(biāo)。以3株細(xì)菌菌液進(jìn)行了2 h的浸種處理后，辣椒種子的萌發(fā)率均在90%左右，較對(duì)照顯著提高了近20%，但不同菌株處理之間并無(wú)顯著性差異(p<0.05)。30 d的盆栽實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照相比，GD 3、KKS-6-N 1、P 5浸種處理的辣椒幼苗鮮重分別增加54.55%、63.64%和45.46%，株高分別增長(zhǎng)85.14%、75.23%和84.69%，根長(zhǎng)分別增長(zhǎng)了69.51%、13.17%和129.76%。顯然，3株茶樹(shù)根際細(xì)菌的浸種處理使辣椒種子的發(fā)芽率明顯提高，且對(duì)辣椒的株高和鮮重具有顯著促生作用；其中，P 5浸種處理的植株根長(zhǎng)明顯高于對(duì)照及其余2個(gè)菌株的處理。
3.2 3株茶樹(shù)根際細(xì)菌浸種對(duì)花生種子萌發(fā)的影響
利用3株茶樹(shù)根際細(xì)菌菌株對(duì)花生進(jìn)行相同的浸種處理，3 d后統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌劑浸種處理組的發(fā)芽率均在90%以上，較對(duì)照種子的發(fā)芽率提高了20%以上，3株細(xì)菌菌株對(duì)種子的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)效果，但不同菌株處理之間對(duì)種子萌發(fā)率并無(wú)顯著差異(圖1)。
圖1 3株茶樹(shù)根際細(xì)菌對(duì)花生種子萌發(fā)的影響
3.3 3株茶樹(shù)根際細(xì)菌灌根處理對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響
為了進(jìn)一步探討根際細(xì)菌對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響作用及內(nèi)在機(jī)制，分別利用3株菌液進(jìn)行灌根處理，培育30 d后測(cè)定花生的生長(zhǎng)性狀(表2)，發(fā)現(xiàn)3株菌株對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響呈現(xiàn)一定差異。與對(duì)照相比，GD 3、KKS-6-N 1、P 5灌根處理的花生幼苗鮮重分別增長(zhǎng)4.63%、26.83%和35.12%，株高分別增加了5.99%、16.22%和32.73%，根重分別增長(zhǎng)21.62%、29.73%和35.14%。生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果顯示，GD 3和KKS-6-N 1接種組的葉綠素含量略低于對(duì)照，而P 5接種組的葉綠素含量較對(duì)照提高了13.47%。結(jié)果(圖2)表明，P 5菌株的灌根處理對(duì)花生幼苗的促生效果顯著，其次為KKS-6-N 1。
表2 3株茶樹(shù)根際細(xì)菌對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響
3.4 P 5菌株灌根處理對(duì)花生植株?duì)I養(yǎng)元素的影響
由于P 5菌株可以顯著促進(jìn)花生幼苗鮮重和株高的增加，因而經(jīng)P 5灌根處理的花生植株進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定(表3)，發(fā)現(xiàn)接種組植株的全氮增高了13.56%，與對(duì)照呈現(xiàn)顯著差異；全鉀含量略有提升，但差異不明顯，而全磷含量基本無(wú)改變(p<0.05)。
注：圖左3株花生為P 5菌株處理，圖右3株為ck。圖2根際促生菌菌株P(guān) 5對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響
表3根際促生菌菌株P(guān) 5對(duì)花生植株?duì)I養(yǎng)元素的影響
3.5 P 5菌株灌根處理對(duì)花生根際土壤三大菌群和功能菌群數(shù)量的影響
由于土壤微生物在土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)及維持土壤肥力方面起著重要作用，實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步從土壤菌群數(shù)量和土壤酶活入手，解析該菌株對(duì)花生的促生機(jī)制。對(duì)P 5菌株灌根處理的花生根際土壤及對(duì)照土壤進(jìn)行三大菌群總數(shù)的測(cè)定(表4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組根際土壤中的細(xì)菌總數(shù)較對(duì)照增長(zhǎng)了2.63倍，真菌總數(shù)增長(zhǎng)了2倍，細(xì)菌數(shù)/真菌數(shù)之比增加了1.32倍，菌劑處理使得細(xì)菌和真菌數(shù)量較對(duì)照呈現(xiàn)顯著差異，而放線菌總數(shù)并無(wú)明顯差異(p<0.05)。由于P 5處理后的花生根際土壤中細(xì)菌總數(shù)顯著提高，因而對(duì)根際土壤中與促生相關(guān)的功能菌群數(shù)量進(jìn)行了測(cè)定(表4)，發(fā)現(xiàn)氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)分別較對(duì)照增高了2倍和2.44倍，溶磷菌數(shù)增高了4.07倍，與土壤氮磷含量直接相關(guān)的氨化細(xì)菌、固氮菌及溶磷菌數(shù)均明顯高于對(duì)照，而解鉀菌數(shù)略有下降，但差異不顯著(p<0.05)。
3.6 P 5菌株灌根處理對(duì)花生根際土壤酶活性的影響
酶活性的測(cè)定結(jié)果(表5)顯示，與對(duì)照相比，處理組根際土壤的蔗糖酶活性增加了1.41倍，過(guò)氧化氫酶活性增長(zhǎng)了2.65倍，脲酶增長(zhǎng)了2.33倍，中性磷酸酶活性基本無(wú)改變，表明P 5浸種處理的花生根際土壤中，蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶及脲酶酶活性均較對(duì)照有顯著提高(p<0.05)。
表6 P 5菌株的16 S rRNA基因相似性比對(duì)
圖3 P 5菌株的16 S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
表4根際促生菌菌株P(guān) 5對(duì)花生根際土壤三大菌群數(shù)量(cfu·g-1)的影響
表5根際促生菌菌株P(guān) 5對(duì)花生根際土壤酶活性的影響
3.7 P 5菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建
利用細(xì)菌16 S rRNA基因的通用引物對(duì)27 F/1492 R對(duì)P 5細(xì)菌的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果獲得1 405 bp的核苷酸序列，經(jīng)NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與其一致性最高的菌株為克雷伯氏菌屬、變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)，與該種A 6128菌株的16 S rRNA基因相似性為99.93%，此外與多株變棲克雷伯氏菌菌株及肺炎克雷伯氏菌NKU_Kleb 8 A 7菌株的相似性均為99.86%(表6)。與同屬內(nèi)的不同種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，可見(jiàn)P 5菌株與Klebsiellavariicola的不同菌株聚于一大枝，且與該種DX 120 E菌株(CP 009274)的16 S rRNA基因在系統(tǒng)樹(shù)上相鄰，因而結(jié)合分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可將P 5菌株鑒定為Klebsiellasp.。
4結(jié)論與討論
本研究中使用的3株細(xì)菌菌株GD 3、KKS-6-N 1和P 5均是從茶樹(shù)根際分離篩選獲得的，浸種試驗(yàn)表明，3株細(xì)菌均可使辣椒及花生種子的發(fā)芽率達(dá)到90%以上，較對(duì)照相比，發(fā)芽率可提高20%左右，對(duì)辣椒及花生種子的萌發(fā)均具有顯著的促進(jìn)作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，目前的花生栽培通常是種子經(jīng)拌種或包衣后進(jìn)行播種，利用菌劑進(jìn)行種子包衣處理不失為一個(gè)提高種子萌發(fā)的有效方式。而辣椒種子常因成熟度不夠、采種技術(shù)不當(dāng)或貯藏方法等原因造成發(fā)芽率降低[22]，研究結(jié)果為利用3株細(xì)菌菌劑進(jìn)行拌種或包衣處理奠定了基礎(chǔ)。
但是，促進(jìn)種子萌發(fā)的菌株不一定會(huì)對(duì)植株的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。張振建等報(bào)道，烏拉爾桿菌PN 133和土壤根瘤桿菌Y 42的浸種均可使莧菜和油麥菜的發(fā)芽率提高，而灌根處理則促生效果并不明顯[23]。利用2株溶磷菌進(jìn)行青稞種子的萌發(fā)試驗(yàn)中，菌株10 BN-11對(duì)增加青稞發(fā)芽率及促進(jìn)生長(zhǎng)效果明顯，菌株12-BN-6對(duì)株高、根長(zhǎng)和鮮重具有明顯的促進(jìn)作用，但可抑制種子的萌發(fā)[24]。王艷燕等的研究發(fā)現(xiàn)，在9種可促進(jìn)辣椒發(fā)芽率提高的菌株中，后續(xù)的穴盤(pán)育苗有促生效果的僅有4株菌，其中對(duì)辣椒下胚軸和主根長(zhǎng)度影響顯著的GH 6-1和GH 5-3并未在苗期表現(xiàn)出顯著的促生作用，說(shuō)明有些菌雖能促進(jìn)種子萌發(fā)，但未必能在后期幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中促進(jìn)其對(duì)養(yǎng)分的吸收[25]。本研究的浸種實(shí)驗(yàn)雖顯示3株細(xì)菌均可明顯提高辣椒和花生種子的發(fā)芽率，且不同菌株的處理并無(wú)顯著差異；但辣椒種子萌發(fā)后的生長(zhǎng)過(guò)程中，3株細(xì)菌對(duì)其后續(xù)的影響略有不一致；而且，在利用菌液的灌根處理中，發(fā)現(xiàn)P 5菌株對(duì)花生幼苗的促生效果顯著高于KKS-6-N 1，GD 3對(duì)幼苗株高及鮮重的影響則并不明顯，這也與報(bào)道的相一致。因而對(duì)于根際細(xì)菌促生作用的研究中，有必要分別對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)進(jìn)行研究，綜合評(píng)判根際細(xì)菌菌株的促生作用。
研究顯示，根際促生菌可提高種子的發(fā)芽率和芽長(zhǎng)，進(jìn)而提高植株的生物量，但植物對(duì)所分離的功能菌株是否具有根際效應(yīng)，是菌株發(fā)揮功能的關(guān)鍵[26]。康貽軍等在評(píng)價(jià)PseudomonaschlororaphisRA 6和BacilluspumilusWP 8浸種和拌土對(duì)豇豆生長(zhǎng)的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌液的浸種處理及108cfu·g-1劑量的菌株拌土處理均可顯著提高豇豆的株高，認(rèn)為浸種處理從原理上講，應(yīng)該不會(huì)對(duì)非根際土壤產(chǎn)生較大影響[27]。Probanza等研究表明，PGPR對(duì)植物土壤中土著微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響可能是其促生的另一個(gè)機(jī)制[28]。研究表明，土壤酶活性與土壤速效養(yǎng)分密切相關(guān)，而土壤微生物數(shù)量大、繁殖快、活性強(qiáng)，直接影響到植物根際有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[29]。因而，為了進(jìn)一步解析和探究P 5菌株對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)機(jī)制，本研究對(duì)接種P 5菌株的花生根際土壤進(jìn)行了土壤微生物及酶活的測(cè)定。由于細(xì)菌、放線菌和真菌是土壤微生物的三大類群，構(gòu)成了土壤微生物的主要生物量，它們的區(qū)系組成和數(shù)量變化能反映土壤生物活性水平[30]。
研究結(jié)果顯示，P 5處理組根際土壤中的細(xì)菌總數(shù)較對(duì)照增長(zhǎng)了2.63倍，真菌總數(shù)增長(zhǎng)了2倍，細(xì)菌總數(shù)/真菌總數(shù)之比增加了1.32倍，而放線菌總數(shù)并無(wú)明顯差異(p<0.05)。多數(shù)報(bào)道表明，接種促生菌均可不同程度地提高土壤細(xì)菌總數(shù)和放線菌數(shù)，降低真菌數(shù)量[31-33]。王興祥等研究認(rèn)為，細(xì)菌型土壤是土壤肥力提高的一個(gè)生物指標(biāo)，真菌型土壤是地力衰竭的標(biāo)志[34]。但在巨尾桉接種固氮菌或解鉀菌的土壤中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌及放線菌數(shù)量增多，而真菌數(shù)量均不同程度的增高[35]。在研究中，真菌數(shù)量雖有明顯提高，但細(xì)菌數(shù)/真菌數(shù)之比仍高于對(duì)照，接種組土壤仍表現(xiàn)為細(xì)菌型土壤。土壤酶活性在一定程度上可以反映土壤肥力狀況。土壤蔗糖酶活性強(qiáng)弱能反映土壤的熟化程度和肥力水平[36]，過(guò)氧化氫酶活性與土壤呼吸作用及土壤微生物活動(dòng)密切相關(guān)[37]，脲酶活性可在一定水平上反映土壤的供氮水平與能力[38]，磷酸酶在土壤有機(jī)磷向無(wú)機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化方面起著重要作用[39]。
研究顯示，除中性磷酸酶外，P 5接種組的根際土壤蔗糖酶、脲酶及過(guò)氧化氫酶均顯著高于對(duì)照，表明根際細(xì)菌P 5的處理活躍了土壤微生物；對(duì)功能菌群數(shù)量的進(jìn)一步測(cè)定結(jié)果表明，氨化細(xì)菌數(shù)、固氮菌數(shù)及溶磷菌數(shù)顯著增高(p<0.05)。氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)量的顯著提高可以提供植物更多所需的氨氮，接種組植株全氮含量的明顯提高與土壤脲酶等酶活性的增高、氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)的顯著提升相一致，這顯然是促進(jìn)花生生長(zhǎng)的原因之一。
多項(xiàng)研究也已證實(shí)土壤酶活性與大豆、小麥及玉米產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[40-41]。此外，P 5菌株經(jīng)分子鑒定為克雷伯氏菌屬，與KlebsiellavariicolaDX 120 E的同源性最高；而Klebsiellavariicola是2004年才發(fā)現(xiàn)的新種，作為內(nèi)生菌，并由于其優(yōu)良的固氮性能被報(bào)道[42-43]；本研究中的P 5菌株是具有一定固氮能力的茶樹(shù)根際細(xì)菌，因而接種了克雷伯氏菌屬的P 5菌株后，顯著提升了花生的全氮含量。值得注意的是，P 5菌株處理的花生全磷含量與對(duì)照基本無(wú)差異，這與根際土壤中性磷酸酶活無(wú)顯著變化相一致，而溶磷菌數(shù)明顯增高的原因還有待進(jìn)一步研究。
綜上所述，Klebsiellasp.P 5菌株的浸種處理可以顯著促進(jìn)辣椒和花生種子的萌發(fā)，灌根處理可以顯著促進(jìn)花生幼苗的生長(zhǎng)，植株的全氮含量明顯提高，這與根際土壤氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)量的顯著增多，土壤蔗糖酶、脲酶及過(guò)氧化氫酶活性的顯著增高直接相關(guān)，研究結(jié)果為下一步利用P 5菌株進(jìn)行拌種或田間施用奠定了理論基礎(chǔ)。
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