不同鹽度和pH環(huán)境下?嗜水氣單胞菌生長曲線變化
嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)廣泛分布在自然界的淡水和海水中，是原發(fā)性致病菌，可感染多種水生動(dòng)物，是引起魚類出血性敗血癥的主要病原，是人、獸、魚共患的致病微生物，在水產(chǎn)學(xué)界、獸醫(yī)學(xué)界和醫(yī)學(xué)界受到廣泛重視。
嗜水氣單胞菌嗜溫性、有運(yùn)動(dòng)力，為條件致病菌。在14.0~40.5℃水溫范圍內(nèi)都可生長，最適溫度為28.0~30.0℃。從生產(chǎn)實(shí)際接收的病例中分析可推斷其主要通過腸道獲得感染，不過能否感染還取決于菌體對(duì)魚腸道組織黏附力的強(qiáng)弱和環(huán)境的適應(yīng)性，通常具有高黏附力和適應(yīng)性的嗜水氣單胞菌株才能產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的外毒素。
菌外膜蛋白在維持細(xì)菌的基本形態(tài)、細(xì)菌代謝物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸及調(diào)節(jié)細(xì)菌有關(guān)物質(zhì)合成方面起著重要的作用。研究表明細(xì)菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可激發(fā)機(jī)體的體液免疫，還可誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
為了更好地預(yù)防該菌對(duì)水產(chǎn)的影響，從養(yǎng)殖環(huán)境上抑制該菌的生長繁殖，本研究探討該菌的環(huán)境適應(yīng)性及其外膜蛋白在不同鹽度和pH環(huán)境下的變化，以期為后續(xù)致病機(jī)制的研究和蛋白疫苗免疫提供理論基礎(chǔ)。
2結(jié)果與分析
2.1生長情況
通過生長曲線（圖1）可以看出，3~6 h為本菌的對(duì)數(shù)生長期，6 h后生長趨于平穩(wěn)達(dá)到穩(wěn)定期。
圖1致病性嗜水氣單胞菌的生長曲線
2.2對(duì)鹽的耐受性
由圖2可知，在15‰與40‰的鹽度下、20‰~30‰鹽度環(huán)境下該菌增長變化差異不顯著，35‰鹽度環(huán)境下較15‰、20‰、25‰和40‰組增長差異顯著，為最適的增長鹽度。
圖2致病性嗜水氣單胞菌對(duì)鹽度環(huán)境的耐受性
不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），相同字母表示差異不顯著（P＞0.05），下同。
2.3耐酸堿性
由圖3可知，pH 2~3的環(huán)境中該菌幾乎不生長，pH=4時(shí)增長較為顯著，此時(shí)該菌增長緩慢；在堿性環(huán)境中（pH=8、9、10）該菌OD值呈下降趨勢，pH=6時(shí)該菌長勢最好，為該菌最適生長的pH環(huán)境。
圖3致病性嗜水氣單胞菌對(duì)pH環(huán)境的耐受性
2.4對(duì)藥敏紙片的敏感性
由抗生素的抑菌試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)喹諾酮類藥物最為敏感（表1），如依諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星等；對(duì)個(gè)別氨基糖苷類抗生素較敏感，如慶大霉素和新霉素；對(duì)個(gè)別香豆素類抗生素和四環(huán)素類藥物中度敏感，如新生霉素和多西環(huán)素；對(duì)磺胺類和氯霉素類抗生素具有耐藥性，如磺胺異惡唑和氟苯尼考等。
表1致病性嗜水氣單胞菌的耐藥性
注：“S”為敏感；“I”為中度敏感；“R”為不敏感。
2.5 HRP?黏蛋白測定
選取達(dá)到穩(wěn)定期的菌株，這一時(shí)期的菌株增長穩(wěn)定，各項(xiàng)理化性質(zhì)達(dá)到最佳峰值。通過HRP-黏蛋白濃度與菌體的黏附作用可以得出最佳吸附值。黏蛋白與菌體存在最佳的吸附效果，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.427 6x－0.021，R2＝0.991 5。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出最佳濃度，最佳的結(jié)合黏蛋白質(zhì)量濃度為0.335 9 mg/mL（圖4）。
圖4菌體與HRP-黏蛋白濃度的黏附效果
2.6蛋白濃度
所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y＝2.246 1x+0.040 4，R2＝0.994 1。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將外膜蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整到0.1 mg/mL進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)。
2.7蛋白條帶
由圖5可知，不同pH和鹽度環(huán)境下，在35~63 ku均有明顯的條帶變化。將條帶切割送生工檢測，鑒定蛋白。通過生工質(zhì)譜檢測鑒定，評(píng)分最高的蛋白為HSP60（60 ku熱休克蛋白）。
圖5不同pH（A）和鹽度（B）環(huán)境下外膜蛋白的變化
2.8 ExPASy的蛋白分析
通過ExPASy-ProtParam tool分析工具進(jìn)行分析，該蛋白氨基酸數(shù)為544，分子質(zhì)量為57 194.87，理論pI為4.87。其帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為80，該蛋白為穩(wěn)定蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)為29.31，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為62；脂肪指數(shù)為98.29，親水性總平均值(GRAVY)為0.014。通過STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測其與相關(guān)蛋白的相互關(guān)聯(lián)，圖6是證據(jù)視圖，蛋白質(zhì)CH60_AERHH在圖中顯示為groL。
圖6 HSP60與其他蛋白的相互作用
3討論
通過分離鑒定篩選出1株致病性嗜水氣單胞菌，在37℃條件下培養(yǎng)3 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)6 h后達(dá)到穩(wěn)定期。由于海水的溫度可達(dá)28℃、鹽度可達(dá)25‰以上、pH 7~8，這些條件均適宜致病性嗜水氣單胞菌增殖生長，這也是該病可發(fā)生在海水魚中的原因之一；
腸道中的選擇性屏障可以調(diào)節(jié)水和小分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。致病菌侵入腸道內(nèi)或者機(jī)體免疫機(jī)能下降都將導(dǎo)致腸道條件致病菌被激活，發(fā)生腸源性感染。
熱休克蛋白(HSPs)是廣泛存在的一類熱應(yīng)激蛋白質(zhì)。小分子熱休克蛋白具有多種功能，包括抗高溫高熱，作為分子伴侶可以有效地防止蛋白聚集，從而對(duì)抗正常的細(xì)胞死亡，讓細(xì)胞數(shù)量達(dá)到平衡。當(dāng)細(xì)胞受到外部刺激時(shí)，許多基因一般并不表達(dá)的小分子熱休克蛋白開始顯著表達(dá)，比如高溫高熱刺激。
研究發(fā)現(xiàn)，除了熱刺激外還有許多化學(xué)、物理刺激可以激活小分子熱休克蛋白的表達(dá)，例如紫外線、機(jī)械損傷、射線、氧化劑、酸等。當(dāng)細(xì)菌侵入機(jī)體時(shí)，HSP60作為外源性抗原可以通過MHCⅡ類分子使T淋巴細(xì)胞發(fā)生致敏，同時(shí)由于細(xì)菌HSP60和動(dòng)物HSP60有高度同源性，所以會(huì)發(fā)生自身免疫。
有研究表明，酵母HSP60因某些應(yīng)激條件出現(xiàn)功能失活或生理缺失則酵母細(xì)胞會(huì)停止生長，大量的線粒體基質(zhì)定位蛋白在HSP60的協(xié)助下仍能夠跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體基質(zhì)中。
熱休克蛋白提高了細(xì)胞的抗應(yīng)激和耐受能力，它可以幫助變性、不可溶的凝聚蛋白重新恢復(fù)天然構(gòu)象。熱休克蛋白參與不同的生物和免疫反應(yīng)，在很多免疫治療中可能都起到重要的作用。后期將通過對(duì)嗜水氣單胞菌外膜蛋白HSP60的自身免疫作用及以HSP60為基礎(chǔ)的自身免疫方法的研究，為水產(chǎn)通過增強(qiáng)自身免疫抵抗病原菌的侵襲提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
本研究為大黃魚致病性嗜水氣單胞菌防治提供一定依據(jù)，為可持續(xù)健康養(yǎng)殖提供新思路，同時(shí)為開發(fā)疫苗免疫增強(qiáng)魚體自身免疫提供理論基礎(chǔ)。
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