熒光分光光度法測(cè)定硫酸鹽還原菌SRB菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線、生長(zhǎng)曲線
煤層氣生物工程技術(shù)是通過(guò)往煤層中注入激活劑或者微生物來(lái)產(chǎn)生以甲烷為主要成分的氣體的生物增采技術(shù)，具有很好的應(yīng)用前景。煤的生物產(chǎn)氣環(huán)境中，微生物為了從煤中獲取能源底物會(huì)選擇性吸附到煤表面形成生物膜，其吸附成膜是微生物啟動(dòng)煤厭氧降解產(chǎn)氣的先決條件，也是煤厭氧降解產(chǎn)氣過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)調(diào)控微生物在煤表面的吸附率，可以促進(jìn)煤的生物產(chǎn)氣量。
硫酸鹽還原菌是煤厭氧降解產(chǎn)氣體系中重要的功能微生物種群，在煤厭氧降解生物產(chǎn)氣前可以在煤表面形成生物膜，改變煤的表面性質(zhì)，影響煤表面有機(jī)成分含量及物質(zhì)結(jié)構(gòu)，為體系中其他產(chǎn)甲烷功能菌提供豐富的前體物質(zhì)，在產(chǎn)氣體系中發(fā)揮關(guān)鍵作用。改變煤表面吸附微生物的數(shù)量，可以影響煤的厭氧降解產(chǎn)氣效率。因此，如何快速準(zhǔn)確測(cè)定微生物在煤表面的吸附率對(duì)了解煤表面生物膜的形成過(guò)程，強(qiáng)化煤層氣的產(chǎn)生效率具有重要意義。
目前表征微生物在礦物表面吸附的方法有比濁法、茚三酮比色法，分光光度計(jì)法等，這些方法主要用來(lái)檢測(cè)好氧微生物在礦物表面的吸附。而煤生物厭氧降解產(chǎn)氣體系中的微生物均是厭氧微生物，對(duì)氧氣敏感，并且煤經(jīng)微生物厭氧降解后會(huì)形成微米級(jí)的煤顆粒，這會(huì)對(duì)傳統(tǒng)的測(cè)定好氧微生物在礦物表面吸附率的方法造成干擾。所以，需要開(kāi)發(fā)一種能適合測(cè)定厭氧微生物如硫酸鹽還原菌在煤表面吸附率的方法。
通過(guò)特異性的熒光染料與微生物結(jié)合可避免煤顆粒對(duì)吸光度的干擾。但是，熒光測(cè)定體系的準(zhǔn)確度會(huì)受到多種因素影響，為了提高其準(zhǔn)確度，需要開(kāi)發(fā)出合適的測(cè)試體系。
為了解決測(cè)定厭氧微生物硫酸鹽還原菌在煤表面吸附率問(wèn)題，下面通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)化了熒光分光光度法的測(cè)試體系，通過(guò)SRB菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線、生長(zhǎng)曲線和在褐煤表面吸附率的測(cè)定進(jìn)行方法驗(yàn)證，表明該方法具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和精密度都較高的優(yōu)點(diǎn)。
熒光分光光度法測(cè)定硫酸鹽還原菌培養(yǎng)體系中菌液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線
在厭氧手套箱中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SRB培養(yǎng)液按照10％接種量接種到新的厭氧培養(yǎng)瓶中，接種完成后進(jìn)行SRB細(xì)胞培養(yǎng)，每隔24h取出1.5mL樣品，按照步驟7中最優(yōu)條件測(cè)定樣品中細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；同時(shí)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)分析培養(yǎng)液中SRB的細(xì)胞濃度；以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體濃度和熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，在同一坐標(biāo)軸內(nèi)建立熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線及SRB細(xì)胞濃度隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線，驗(yàn)證熒光強(qiáng)度與細(xì)胞濃度變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
通過(guò)在厭氧環(huán)境下對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理，使用熒光分光光度法并控制吖啶橙與十二烷基磺酸鈉用量對(duì)硫酸鹽還原菌的熒光值進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)使用密閉比色皿可以保持在檢測(cè)過(guò)程中的厭氧環(huán)境，維持厭氧菌活性，結(jié)合血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)硫酸鹽還原菌在煤表面吸附率的快速測(cè)定。該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)厭氧環(huán)境中微生物數(shù)量的快速檢測(cè)，并保持微生物活性，適用于多種類型的厭氧微生物，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。