生防菌株不同生長階段時發(fā)酵液色素與OD650 nm的變化
摘要：真菌GD-2和HZ-31是2株分離于雜草中的具有生防潛力的生防菌株，為進(jìn)一步研究2株菌株的發(fā)酵培養(yǎng)及田間應(yīng)用技術(shù)，進(jìn)行了生防菌株生長特性研究。通過室內(nèi)PAS培養(yǎng)基培養(yǎng)，裝液量為100 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，培養(yǎng)10 d，觀察測定培養(yǎng)過程中發(fā)酵液顏色、菌絲干重變化、OD650 nm和pH，并利用聚類分析方法劃分生防菌株生長階段。結(jié)果表明，在培養(yǎng)過程中，生防菌株發(fā)酵液的顏色、菌絲干重、OD650 nm和pH都會隨著培養(yǎng)時間而變化。在相同的培養(yǎng)條件下，來源于不同寄主的生防菌菌株之間在顏色、菌絲干重變化、OD650 nm和pH變化表現(xiàn)出差異。2株生防菌菌株的生長分為3個階段，1～2 d為適應(yīng)階段，3～5 d為對數(shù)生長階段，6～10 d為穩(wěn)定階段。生防菌株在培養(yǎng)過程的發(fā)酵液色素變化和OD650 nm的變化可作為生防菌株培養(yǎng)的表征性特征。
真菌在生長、產(chǎn)孢、萌發(fā)時對營養(yǎng)和環(huán)境條件都有其基本的和特殊的需求，了解真菌生長、產(chǎn)孢和萌發(fā)的具體特性和要求，對植物真菌病害的研究具有重要意義。不同真菌在不同地區(qū)的分布又有所不同，這種差異反映了生防菌對生長環(huán)境的選擇，表現(xiàn)在其對不同環(huán)境利用的生長特性上。在特定的培養(yǎng)條件下，真菌發(fā)酵液的顏色、菌絲干重、發(fā)酵液吸光度和pH等的變化，都能反映真菌的生長特性。針對篩選出的具有良好生防潛力的2株真菌，研究生長特性，了解適宜培養(yǎng)條件，對進(jìn)一步研究該菌株的生物防治應(yīng)用具有重要意義。菌株GD-2和HZ-31是青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選出的對野燕麥具有防除效果的生防菌株[1，2]，本研究對該生防菌株的生長特性進(jìn)行了研究，有助于了解其培養(yǎng)特性的差異，尋找培養(yǎng)過程的異質(zhì)性指標(biāo)，為進(jìn)一步的生物學(xué)研究發(fā)酵生產(chǎn)、制劑研制及田間應(yīng)用等奠定基礎(chǔ)。
1材料及方法
1.1試驗(yàn)材料
菌株：供試菌株及來源見表1。
培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL）；液體培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）。
1.2試驗(yàn)方法
生防菌株培養(yǎng)：將生防菌在PDA平板上培養(yǎng)7 d，打取3個6 mm的菌片，置于盛有100 mL PSA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min，每天取3瓶，過濾菌絲，收集發(fā)酵液。
觀察測定：①觀察生防菌株生長過程發(fā)酵液顏色的變化。②測定生防菌株生長過程菌絲干重的變化。收集發(fā)酵液在5 000 r/min離心15 min，倒掉上清液后菌體用去離子水洗滌，離心，反復(fù)3次后放到50℃的烘箱中烘至恒重，在分析天平上準(zhǔn)確稱重。③測定生防菌株生長過程OD650 nm的變化。將發(fā)酵液5 000 r/min離心，取上清液，用UV751GD型分光光度計(jì)（上海精科）測定OD650 nm。④測定生防菌株生長過程中pH的變化，分析生防菌株的生長特性。
分析生防菌株的生長階段，以生防菌株培養(yǎng)時間為分類，以菌株GD-2和HZ-31的菌絲干重、OD650 nm、pH為指標(biāo)，構(gòu)建矩陣。以歐氏距離為相關(guān)尺度，用類平均法進(jìn)行聚類分析。
1.3統(tǒng)計(jì)分析
采用Eecel軟件作圖，DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2結(jié)果與分析
2.1生防菌株生長過程發(fā)酵液顏色的變化
2株生防菌株在培養(yǎng)過程顏色變化不同。發(fā)酵液顏色會發(fā)生階段性變化，在發(fā)酵初期（1～3 d），生防菌菌株GD-2和HZ-31的發(fā)酵液顏色與培養(yǎng)基配制時的顏色相同，沒有明顯的變化。在發(fā)酵中期（4～6 d），2株菌株發(fā)酵液的顏色發(fā)生明顯變化，菌株GD-2發(fā)酵液在4 d時變?yōu)槟厅S色，在6 d時顏色加深，轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色；而菌株HZ-31發(fā)酵液在4 d時則變?yōu)榈S色，在6 d時顏色加深轉(zhuǎn)變?yōu)樯铧S色。在發(fā)酵后期（7 d以后），2株生防菌發(fā)酵液保持發(fā)酵6 d時的顏色，沒有明顯變化。
2.2生防菌株生長過程中菌絲干重的變化
菌株GD-2和菌株HZ-31培養(yǎng)過程中菌絲干重的變化趨勢相差較大，2株菌株的菌絲干重增加量情況存在較大差異（圖1）。菌株GD-2菌絲干重增加量最大的時間為5～8 d，8 d時的菌絲干重達(dá)到最大值（499.8 mg/100 mL），隨后的變化趨于平緩。而菌株HZ-31增加量最大的時間為1～4 d；4 d時的菌絲干重達(dá)到最大值，為834.4 mg/100 mL，隨后菌絲干重急劇下降。在培養(yǎng)初期菌株HZ-31的生長速度快于GD-2菌株，到培養(yǎng)后期HZ-31菌絲干重明顯低于GD-2菌株菌絲干重，2株菌株的菌絲干重的變化出現(xiàn)明顯差異，這可能與菌株的生物學(xué)特性和對培養(yǎng)基的適應(yīng)性有關(guān)。
2.3生防菌株生長過程中OD650 nm的變化
由吸光度得到的生長曲線可以認(rèn)為是微生物生長狀況的宏觀表現(xiàn)。通過測定不同培養(yǎng)時間的OD650 nm，可大體劃分微生物生長的不同生長時期，為批量生產(chǎn)提供依據(jù)。菌株GD-2和菌株HZ-31發(fā)酵過程中發(fā)酵液離心上清液的OD650 nm變化如圖2。2株菌株發(fā)酵過程中變化趨勢基本類似，隨著發(fā)酵進(jìn)程OD650 nm逐漸增高，在發(fā)酵中期出現(xiàn)最高峰值，但是不同的菌株出現(xiàn)峰值的時間不同。GD-2菌株出現(xiàn)2個峰值，在3 d和5 d分別為0.103和0.114，之后OD650 nm變化幅度較大，8 d時達(dá)到最低峰（0.027）；而HZ-31變化較緩慢，7 d時達(dá)到最低峰（0.027）。
2.4生防菌株生長過程中pH的變化
菌株GD-2和菌株HZ-31發(fā)酵過程中pH的變化趨勢相差較大（圖3）。菌株GD-2培養(yǎng)初期（1～3 d），pH為6.50～6.19，培養(yǎng)中期（4～6 d），pH為5.78～5.87，此時pH上升很快，培養(yǎng)后期（7～10 d），pH為6.02～8.34，變化最快，在培養(yǎng)的2～5 d，pH有所下降。菌株HZ-31從培養(yǎng)初期的6.23逐漸升高為培養(yǎng)后期的9.08～9.04，在4 d時略有波動，從5 d開始，pH的變化趨于平緩。結(jié)果表明，2株菌株發(fā)酵液的pH從最初的6.2左右逐漸升高8.34和9.04，培養(yǎng)過程中2株菌株pH變化過程差異較大。
2.5生防菌株生長階段聚類分析
用聚類分析方法對培養(yǎng)時間進(jìn)行歸類。以培養(yǎng)時間為分類，以菌株GD-2和HZ-31的菌絲干重、OD650 nm、pH為指標(biāo)，構(gòu)建矩陣，用歐氏距離為相關(guān)尺度，以類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，聚類過程見表2。培養(yǎng)時間對菌絲干重、OD650 nm、pH影響見圖4。分析結(jié)果表明，當(dāng)λ=81.5時，可將生防菌菌株的生長分為3個階段，第一個階段為適應(yīng)期，培養(yǎng)時間為1～2 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較小，菌株生長處于適應(yīng)階段。第二階段為對數(shù)期，培養(yǎng)時間為3～5 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較大，菌株處于對數(shù)生長階段。第三階段為穩(wěn)定期，培養(yǎng)時間為6～10 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化平緩，菌株生長處于穩(wěn)定階段。
3小結(jié)與討論
2株生防菌株在培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液的顏色、菌絲干重、OD650 nm和pH都會隨著培養(yǎng)時間而變化。在相同的培養(yǎng)條件下，來源于不同寄主的2株生防菌株在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液顏色不同，同一菌株生長過程中發(fā)酵液顏色會發(fā)生階段性變化，與其生理特性有關(guān)，也是菌株培養(yǎng)特征之一。2株菌株培養(yǎng)過程中OD650 nm隨培養(yǎng)進(jìn)程的變化而變化，在發(fā)酵期間出現(xiàn)峰值，而且峰值出現(xiàn)的時間不同。OD650 nm為生防菌株生長過程中的生理變化特征之一。生防菌株在培養(yǎng)過程中色素變化和OD650 nm的變化可作為生防菌株培養(yǎng)的表征性特征。這些性狀的變化與生防菌的萌發(fā)、侵染以及傳播等生物學(xué)特性的關(guān)系有待于進(jìn)一步的研究。
2株生防菌株培養(yǎng)過程中pH增高，從最初6左右升高到后期的8.34和9.04，2株生防菌株培養(yǎng)程中pH變化差異較大。2株生防菌株在培養(yǎng)過程中，菌絲干重隨時間變化而變化，菌絲干重增加量最大的時間分別為2～4 d和5～8 d，而且菌絲干重增加的量存在較大差異。
在培養(yǎng)溫度（25±1）℃條件下，HZ-31菌株在培養(yǎng)時間4 d時，菌絲干重最大，為834.4 mg/100 mL，pH為7.71；GD-2菌株在培養(yǎng)到8 d時菌絲干重達(dá)到最大值，為499.8 mg/100 mL，pH為7.38，說明2株生防菌株對pH有一定的選擇性，表現(xiàn)為均偏好偏堿性的生長條件。
采用PSA液體培養(yǎng)基在（25±1）℃的條件下，來自野燕麥的GD-2菌株的生長分為3個階段：1～2 d為適應(yīng)階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較小；3～5 d為對數(shù)生長階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化大；6～10 d為穩(wěn)定階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化平緩。而菌株HZ-31的前期生長速度高于GD-2菌株，對數(shù)生長期提前到來，這可能與菌株的生物學(xué)特性和對培養(yǎng)基的適應(yīng)性有關(guān)，這與前人研究結(jié)果基本一致[3-6]，因此，在進(jìn)行生防菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，需注意在對數(shù)生長階段的營養(yǎng)供給和培養(yǎng)條件的控制。
研究2株生防菌株的生長特性，對生防菌株的發(fā)酵培養(yǎng)具有較好的指導(dǎo)作用，在實(shí)際的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及田間應(yīng)用方面，還存在著復(fù)雜的影響因素，需要進(jìn)一步研究。
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