不同的光照度、初始pH值、搖動次數等對光合細菌生長的影響
光合細菌（Photo Synthetic Bacteria簡稱PSB）是一類能夠在厭氧和光照條件下進行光合作用且不產生氧氣的一類細菌的總稱。它廣泛存在于自然界的湖泊、江河、海洋、水田、氧化池、活性污泥槽、污水溝內，其菌體營養豐富，細胞干物質中蛋白質含量達60%以上，而且蛋白質氨基酸組成齊全，含有機體必需的16種氨基酸且各種氨基酸的比例較合理。還含有豐富的B族維生素，尤其是維生素B12、葉酸、生物素等含量高[1]。大量的應用研究證明，光合細菌可明顯提高養殖動物的生長速度和抗病能力，而且具有重要的優化水質，改善養殖環境的功能，在畜牧、水產養殖和環境污水治理等領域都有非常重要和廣泛的應用前景。目前，對光合細菌培養條件的研究，國內外已有許多相關報道，但眾說不一，均停留在室內用燈光培養。這種培養方式耗能大、成本高，不利于光合細菌的推廣應用。因此，如何因地制宜利用空閑地在自然環境條件下快速擴培光合細菌已成為迫切需要解決的技術問題。為此，我們承擔了廣西直屬公益性科研院所基本科研業務費專項資金自主選題項目“光合細菌快速擴培技術研究”，采用單因子優化試驗考察不同的光照度、初始pH值、初始接種濃度、氧需求程度、搖動次數等對光合細菌生長的影響。
1試驗材料
1.1試驗菌株
試驗菌株PSB由廣西水產科學研究院南寧海可海樂微生物公司從高產蝦塘底泥中分離獲得并培養保存，經鑒定為紅螺菌科沼澤紅假單胞菌（菌株編號NC01），活菌數≥4×109個/mL，雜菌率≤10%，深紅色，粘稠狀液體。
1.2培養基
液體配方：使用廣西水產科學研究院南寧海可海樂微生物公司優化篩選的擴大培養基，其基本成分如下[2]：CH3COONa 3.3 g、KH2PO4 060 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 2.00 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、CaCl2 50 mg、MnSO4 25 mg、FeSO4 5.00 mg、酵母膏1.0 g、調節pH值至7.0、曝氣自來水1 000 mL。
2光合細菌生長的測定
菌體濃度：用7504型分光光度計，在660 nm波長處，測定培養物光密度值（OD）；
細胞數量：用光合細菌基礎培養基[3]，以平板菌落計數法測定。
3室外培養參數的優化
3.1光照度對光合細菌生長的影響
將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的培養基中，置于室外自然光源下（溫度控制在35℃左右），采用增減遮陰網疏密來調節光照度，設置5個梯度：分別為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 lx，每個梯度設置2個重復，靜置培養6 d后取樣測定，探討其生長情況。
從表1可見，光合細菌在光照強度2 000～10 000 lx的范圍內均可以生長，而且在2 000～8 000 lx范圍內，光強度越大，光合細菌的生長速度就越快，生物量也越大，而且菌液粘稠均勻，無分層、無附壁。但在10 000 lx強光照度下，光合細菌的生長明顯受到了抑制，菌液顏色發生變化且分層、附壁現象較嚴重。因此，光合細菌比較適宜在光強度為6 000～8 000 lx下培養。在實際批量生產過程中可采用增減遮陰網疏密來調節光照度實現室外自然光照培養。
3.2初始pH值對光合細菌生長的影響
先配制液體培養基，采用1 mol/L的醋酸和5%碳酸氫鈉溶液調節液體培養基的初始pH值。共調節6個梯度，分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每個梯度設置2個重復。將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的培養基中，置于室外溫度控制在35℃左右、6 000 lx光照度下靜置培養6 d后取樣測定，探討其生長情況。
從表2得知，光合細菌在pH值6.5～9.0范圍內均能良好生長，但不同的初始pH值對光合細菌生長產生不同影響。從測定的數據可以看出，各組之間，OD值、活菌數量差異明顯。初始pH 7.0時生長最好，OD值達1.98、最高活菌數量達4.38×109個/mL，其次是pH 7.5。最差是pH 9.0，OD值為0.65、最高活菌數量1.44×109個/mL。由于光合細菌的代謝產物為堿性，隨著培養時間的遞增，各組pH呈現不斷上升的趨勢，光合細菌活菌數量也不斷增加。因此，在培養過程中，必須隨時測定和調整pH值，pH值過高或過低對光合細菌的生長都不利。為了延長光合細菌的對數生長期，當pH值上升超出最適范圍時，可以采用加1 mol/L的醋酸溶液調整菌液pH值。
3.3初始接種濃度對光合細菌生長的影響
將活化后的菌種以10%、20%、30%、40%、50%接種于已滅菌的培養基中，每個梯度設置2個重復。置于室外溫度控制在35℃左右、6 000 lx光照度下靜置培養6 d后取樣測定，探討其生長情況。
從表3得知，初始接種濃度對光合細菌生長的影響很大，初始接種濃度越高，光合細菌的生長就越快，達到最高活菌數量的時間就越短。比較不同初始接種濃度對光合細菌生長的影響發現，初始接種濃度在20%～40%時對最終的生物活菌數量影響不大，而初始接種濃度在10%時，光合細菌在培養液中很難占絕對優勢，培養初期易長雜菌，生長緩慢。初始接種濃度在50%時，生長速度快、很容易形成優勢菌群而抑制其他雜菌生長、培養周期較短，但從大批量生產的角度來講，成本相對較高；初始接種濃度低，培養周期相對有所延長，但成本降低。綜合考慮各方面的因素，在室外大批量生產中，建議采用30%初始接種濃度，相對延長培養時間的方法來提高活菌數量。
3.4氧需求程度對光合細菌生長的影響
氧需求程度的調控設置3個梯度，分別為：完全厭氧培養、有孔瓶蓋培養、開蓋培養，每個梯度設置2個重復。將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的培養基中，置于室外溫度控制在35℃左右、6 000 lx光照度下靜置培養6 d后取樣測定，探討其生長情況。
光合細菌在完全厭氧、有孔瓶蓋培養、開蓋培養條件下均能進行正常的生理活動。但不同的氧需求程度對光合細菌最終的OD值、活菌數影響還是比較大的。在有孔瓶蓋培養條件下生長代謝最為旺盛，最高活菌數達4.31×109個。其次是完全厭氧，最高活菌數3.98×109個。最差是開蓋培養，由于雜菌感染，生長緩慢最高活菌數僅有2.26×109個。完全厭氧與有孔瓶蓋培養相比，差異不明顯，但與開蓋培養相比，則差異顯著。由于是室外培養，考慮到受天氣等外界條件的影響，因此采用完全厭氧培養方式是切實可行的。
3.5搖動次數對光合細菌生長的影響
搖動次數的調控設置3個梯度，分別為：每天搖動次數1次、2次和不搖動的培養方式。將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的培養基中，置于室外溫度控制在35℃左右、6 000 lx光照度下靜置培養6 d后取樣測定，探討其生長情況。
結果表明，在培養過程中適當搖動對光合細菌的生長還是非常有利的，搖動1次，2次的OD值、活菌數明顯高于不搖動。適當搖動可以使沉底的光合細菌上浮，在培養液中分布更加均勻，更好地獲得光照，從而促進細胞的更好生長。因此，在培養過程中建議每天搖動1～2次。
4結論
本研究結果表明，光合細菌快速擴培最為關鍵的技術問題就是創造有利于光合細菌生長的良好環境及減少雜菌的污染。其最適光照度6 000～8 000 lx、初始pH值為7.0～7.5、最佳接種量為30%、厭氧培養、每天搖動1～2次，一般培養6 d可使光合細菌活菌數≥4×109個/mL，雜菌率≤10%，為在自然環境條件下快速擴培光合細菌提供有效的技術支撐。
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