煙曲霉生長曲線變化與致死溫度研究
侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)是一種嚴(yán)重威脅生命的疾病，在白血病和骨髓移植受者等免疫受損機體中病死率超過90%。煙曲霉是引起IA的最主要致病菌，約占90%，目前其對人體的致病機制尚不清楚。無論是在外界環(huán)境中還是進(jìn)入機體內(nèi)，煙曲霉都面臨生存環(huán)境的變化，這些變化統(tǒng)稱為應(yīng)激，其中生存環(huán)境溫度的變化是煙曲霉面臨的最基本的應(yīng)激。溫度是影響微生物生長的重要因素之一，不同物種對環(huán)境溫度變化具有不同的適應(yīng)能力。
煙曲霉是什么菌？
煙曲霉被認(rèn)為是一種耐熱真菌，這種特性使其對環(huán)境變化的抵抗力更強。有研究發(fā)現(xiàn)，在30～42℃間，煙曲霉都能較好的生長，此外，在對肥料發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，煙曲霉能抵御60～80℃高溫。但是，對于煙曲霉耐受高溫的程度在以往研究中并沒有確切的描述。
本研究通過測定煙曲霉在不同溫度下的生長曲線及其在更高溫度下的存活率，確定煙曲霉的最適生長溫度、最高生長溫度及致死溫度，從而對煙曲霉耐高溫生長的生理學(xué)特性有更準(zhǔn)確的認(rèn)識。
絲狀真菌的生長可分為5個階段，分別是靜止期、第一過渡期、對數(shù)生長期、第二過渡期及穩(wěn)定期。在第一過渡期時，孢子開始腫脹發(fā)芽，但菌絲延長不明顯，生長曲線較平滑，表現(xiàn)出緩慢上升趨勢;當(dāng)處于對數(shù)生長期時，菌絲生長速度最快，生長曲線達(dá)到最大斜率;當(dāng)處于第二過渡期時，菌絲延伸速度下降，生長曲線斜率下降，再次變得平滑。生長曲線能夠直觀的反映出絲狀真菌的生長情況，因此，我們應(yīng)用生長曲線法評價煙曲霉的生長狀況。我們選用了三種研究曲霉生理特性時較常用的培養(yǎng)基:YG培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，除了必需成分外，還含有微量元素和維生素，特別利于菌株生長;MM培養(yǎng)基成分與察氏培養(yǎng)基類似，但嚴(yán)格限定了pH值，在研究不同營養(yǎng)成分、不同酸堿環(huán)境對菌株生長的影響時可以精確改變營養(yǎng)條件;YNB培養(yǎng)基中無碳源，可以用來研究菌株對不同碳源的利用情況。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，相同溫度下，YG培養(yǎng)基中測得的生長曲線能更完整的反映出煙曲霉的生長周期，最適宜用來觀察溫度對煙曲霉生長的影響。
圖1兩株煙曲霉菌株在不同培養(yǎng)基中的生長曲線(MM.曲霉基礎(chǔ)培養(yǎng)基，YNB.酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，YG.酵母浸膏培養(yǎng)基)圖2煙曲霉在不同溫度下的生長曲線:a.AF293，b.DAL圖3兩株煙曲霉菌株在高溫下的活力曲線
雖然研究普遍認(rèn)為煙曲霉是一種耐熱真菌，但對其耐受高溫的程度，并沒有確切的描述。我們發(fā)現(xiàn)，在YG培養(yǎng)基中，煙曲霉的最適宜生長溫度為37℃，在此溫度下其生長最好。這也是煙曲霉容易感染人體的一個重要原因。當(dāng)溫度達(dá)到48℃時，煙曲霉的生長受到一定程度的抑制，但在不同菌株中情況并不完全一致:在AF293中觀察到，菌株的生長受到明顯的抑制，第一生長過渡期延長，菌株進(jìn)入對數(shù)生長期時間延長，生長曲線斜率較37℃明顯下降;而在DAL中卻觀察到，雖然菌株第一生長過渡期延長，但進(jìn)入對數(shù)生長期后，菌株的生長并未減緩。當(dāng)溫度達(dá)到52℃時，兩株煙曲霉菌株均表現(xiàn)出明顯的生長受抑，生長曲線斜率最小。以往關(guān)于真菌對溫度耐受的研究中，多集中于30℃到37℃或42℃的溫度改變引起的轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平的變化。由于煙曲霉是一種耐熱真菌，研究發(fā)現(xiàn)30～37℃的溫度改變不足以引起其與毒力相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變。因此，其后對煙曲霉熱休克反應(yīng)的研究多將刺激溫度選為48℃［13-14］。但是我們發(fā)現(xiàn)，煙曲霉菌株在48℃時仍具有良好的生長能力，并且不同的菌株對48℃的反應(yīng)不完全一致;當(dāng)溫度達(dá)到52℃時，兩株煙曲霉才表現(xiàn)出明顯的生長受抑。該結(jié)果提示，在煙曲霉對高溫耐受的研究中，應(yīng)該選擇52℃作為刺激條件。
既往研究認(rèn)為煙曲霉能夠耐受肥堆的高溫發(fā)酵階段，但其致死溫度不清楚。因此，本研究還測定了煙曲霉菌株的致死溫度;致死溫度指一定條件下和一定時間內(nèi)殺死微生物的最低溫度。我們發(fā)現(xiàn)，65℃持續(xù)刺激180 min或70℃刺激120 min可完全殺死煙曲霉。由于高于70℃的溫度會使固體培養(yǎng)基熔化，因此我們無法得到高于70℃時煙曲霉的致死條件。這有待于在將來的研究中改進(jìn)實驗方法以闡明。
本研究中得到的煙曲霉最適生長溫度、最高生長溫度及致死溫度雖然具有一定的代表性，但仍需在未來研究中擴(kuò)大樣本量以驗證;我們的結(jié)果也提示，無論是以標(biāo)準(zhǔn)菌株還是臨床菌株為研究對象，都需要預(yù)先了解該菌株的生理特性，以合理選擇實驗條件。
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