不同條件下裂片石莼水培液的組成成分對(duì)耐藥弧菌株的抑菌作用（二）
1、材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
裂片石莼(Ulva fasciata)購(gòu)自于廣東省汕頭市南澳島(117°02′E，23°42′N(xiāo))，清洗干凈后置于人工海水(1 kg海水素溶于28.5 L純水，鹽度為35，海水素購(gòu)自青島海之鹽水族科技有限公司)中適應(yīng)性培養(yǎng)2 d。為減少細(xì)菌的影響，用抗生素(0.75 mg/L多黏菌素、0.75 mg/L氯霉素、0.9 mg/L新霉素和100 mg/L氨芐青霉素)處理48 h。
為獲得不同密度海藻分泌物水培液，稱取上述新鮮裂片石莼1.25 g、2.5 g、5 g、10 g和分別置于1 L滅菌后的人工海水中培養(yǎng)(光強(qiáng)為(200±25)μmol/m2/s，光周期為24 h光照:0 h黑暗，25℃下持續(xù)曝氣)。收集培養(yǎng)1 d和3 d的水培液，通過(guò)0.22μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾后儲(chǔ)存在無(wú)菌離心管中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
用于分離弧菌的養(yǎng)殖水、沉積物和養(yǎng)殖動(dòng)物樣品分別從浙江省舟山市普陀區(qū)朱家尖的白蝦、南美白對(duì)蝦和菲律賓蛤仔3種不同海水養(yǎng)殖場(chǎng)中采集。
藥敏紙片:頭孢唑林(Cefazolin)、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢西丁(Cefoxitin)、阿莫西林(Amoxicillin)、氨芐青霉素(Ampicillin)、哌拉西林(Piperacillin)、左氧氟沙星(Levofloxacin Tablets)、美羅培南(Meropenem)、亞胺培南(Imipenem)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、阿米卡星(Amikacin)、卡那霉素(Kanamycin)、復(fù)方新諾明(Sulfamethoxazole)、慶大霉素(Gentamycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、四環(huán)素(Tetracycline)、鏈霉素(Streptomycin)，以上全部購(gòu)自于杭州微生物試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)藥劑鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP)、乙縮醛(Acetal)、2-(4-羥基苯)乙醇(p-HPEA)和2，4，6-三溴苯酚(TBP)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢唑啉和哌拉西林購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。
1.2弧菌分離鑒定和耐藥性表征
1.2.1弧菌分離鑒定
取10 mL水樣轉(zhuǎn)移到40 mL 3%NaCl堿性蛋白胨水(APW)中;取10 g沉積物加入10 mL人工海水并離心(4 000 r/min，10 min);將蝦、蛤仔內(nèi)部組織肉經(jīng)研磨后加入10 mL蒸餾水離心(4 000 r/min，10 min)，將上清液加入到3%NaCl APW中，并在37℃條件下培養(yǎng)24 h獲得不同的菌懸液。采用平板劃線分離法，將菌懸液用接種環(huán)沾取至硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽汁酸鹽蔗糖瓊脂(TCBS)和法國(guó)科瑪嘉培養(yǎng)基(CHROMagar?)上純化鑒定，經(jīng)多次劃線分離后獲得較純的菌株。將分離菌株按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.7-2013進(jìn)行生化鑒定，并進(jìn)一步進(jìn)行DNA提取和16S rDNA測(cè)序以鑒定菌種。
1.2.2分離弧菌耐藥性表征
參考臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的紙片擴(kuò)散法檢測(cè)分離弧菌對(duì)各種常見(jiàn)抗生素的耐藥性。用無(wú)菌棉拭蘸取0.5麥?zhǔn)蠞岫?1.0×108 CFU/mL)的菌懸液涂布于Mueller-Hinton瓊脂平板表面，再將抗生素藥敏紙片貼至平板上，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈的直徑大小并判斷其藥物敏感(sensitive，S)、中介(intermediate，I)及耐藥(resistant，R)水平(表1)。
表1弧菌對(duì)各抗生素的耐藥程度對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑
抗生素抑菌圈直徑/mm
敏感(S)中介(I)耐藥(R)
阿莫西林≥18 14~17≤13
氨芐青霉素≥17 14~16≤13
頭孢唑林≥18 15~17≤14
哌拉西林≥21 18~20≤17
美羅培南≥16 14~15≤13
阿米卡星≥17 15~16≤14
氨芐青霉素≥23 15~22≤14
頭孢西丁≥18 15~17≤14
卡那霉素≥18 14~17≤13
頭孢他啶≥18 15~17≤14
環(huán)丙沙星≥21 16~20≤15
左氧氟沙星≥17 14~16≤13
慶大霉素≥15 13~14≤12
亞胺培南≥16 14~15≤13
氯霉素≥18 13~17≤12
鏈霉素≥15 12~14≤11
復(fù)方新諾明≥16 11~15≤10
四環(huán)素≥19 15~18≤14
1.3裂片石莼水培液對(duì)弧菌的抑制特性
1.3.1裂片石莼水培液對(duì)弧菌生長(zhǎng)的抑制性能實(shí)驗(yàn)
采用改良后的紫外分光光度法檢測(cè)弧菌的生長(zhǎng)情況。將分離的弧菌轉(zhuǎn)移到3%NaCl胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中培養(yǎng)獲得菌懸液，通過(guò)稀釋分別獲得1.0×105 CFU/mL和1.0×103 CFU/mL的稀釋液，用酶標(biāo)儀在600 nm處每隔1 h測(cè)定吸光度，計(jì)算不同弧菌24 h內(nèi)的生長(zhǎng)變化，以無(wú)弧菌的3%NaCl TSB溶液作為空白對(duì)照，設(shè)置3組平行。
分別取9 mL不同密度的裂片石莼水培液于不同試管中作為實(shí)驗(yàn)組，加入1 mL弧菌菌懸液(1×105 CFU/mL);陽(yáng)性組為9 mL的人工海水和1 mL相同濃度的弧菌菌懸液;分別以9 mL的不同密度裂片石莼水培液和人工海水作為實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性組的陰性對(duì)照，并加入1 mL滅菌的3%NaCl TSB溶液。所有組別均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h測(cè)定OD600nm值。弧菌抑制率計(jì)算公式為:
其中I為弧菌抑制率(%)，A為對(duì)照組弧菌OD600 nm，B為實(shí)驗(yàn)組弧菌OD600 nm，C為陽(yáng)性組OD600 nm，D為陽(yáng)性組的陰性對(duì)照OD600 nm，E為實(shí)驗(yàn)組OD600 nm，F(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組的陰性對(duì)照OD600 nm。
1.3.2水培液成分分析
利用固相萃取(Waters OAsis HLB固相萃取柱)將過(guò)濾后的裂片石莼水培液和人工海水濃縮到固相小柱中，控制流速低于5 mL/min，每根固相小柱通過(guò)2 L樣品溶液。加樣結(jié)束后，使用30 mL超純水進(jìn)行淋洗以洗去柱內(nèi)雜質(zhì)，繼續(xù)使用真空泵抽干1 h。取10 mL甲醇加至固相小柱中洗脫，分3~4次進(jìn)行，最后將洗脫液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35℃)濃縮至1 mL，0.22μm過(guò)濾除菌后備氮?dú)獯蹈伞＜尤?0μL甲氧銨鹽酸鹽吡啶溶液(15 mg/mL)渦旋2 min后于37℃下進(jìn)行90 min肟化反應(yīng)，再加入80μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)衍生試劑，渦旋2 min后于70℃反應(yīng)1 h，室溫靜置30 min，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)進(jìn)行檢測(cè)。
GC-MS分析儀器為8890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent，USA)，進(jìn)樣量為1μL，分流比為10∶1，色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱。進(jìn)樣口溫度260℃，載氣為高純氦氣，程序升溫60~310℃，質(zhì)譜儀電子轟擊能量70 eV。GC-MS的原始文件通過(guò)MassHunter workstation Quantitative Analysis(v10.0.707.0)進(jìn)行搜庫(kù)鑒定及數(shù)據(jù)預(yù)處理，將質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫(kù)(主要為Fiehn database等商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)以及自建的數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行匹配，根據(jù)質(zhì)譜匹配度鑒定代謝物并予以分析。
1.3.3裂片石莼水培液主要成分對(duì)弧菌的最小抑菌
采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)代謝物對(duì)弧菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，同時(shí)以抗生素阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢唑啉和哌拉西林對(duì)弧菌的MIC為參照。在96孔板中通過(guò)二倍稀釋法得到不同濃度水培液代謝物和抗生素的稀釋液，將100μL稀釋液與等量菌懸液(1.0×105 CFU/mL)于37℃培養(yǎng)24 h后，以孔內(nèi)完全澄清，且濃度最低孔的濃度為MIC。
1.4統(tǒng)計(jì)分析
方差分析(ANOVA)用于估計(jì)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，單樣本t檢驗(yàn)用于比較樣本均值與總體均值之間的差異(IBM SPSS Statistics 26.0)，P<0.05為顯著差異。使用Origin 2021繪制主成分分析(PCA)，將PC1和PC2繪制在一起，根據(jù)數(shù)據(jù)在空間某一方向的投影值的距離進(jìn)行比較分析，以確定不同培養(yǎng)時(shí)間和密度下的海藻水培液的化合物成分差異。
相關(guān)新聞推薦
1、25種天然植物精油對(duì)藍(lán)莓致病菌生長(zhǎng)曲線、抑制作用（二）
2、一種利用藻類(lèi)生長(zhǎng)曲線原位區(qū)域優(yōu)化控制藻類(lèi)濃度的方法
3、不同質(zhì)量濃度水飛薊賓對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株的生長(zhǎng)抑制曲線（一）