茂源鏈霉菌提高谷氨酰胺轉氨酶產量方法【研究進展】
茂原鏈霉菌高效合成耐熱谷氨酰胺轉胺酶
近日，Journalof Agricultural and Food Chemistry在線發表了江南大學未來食品科學中心和生物工程學院陳堅院士團隊劉松研究員課題組的研究成果“Efficient Production of a Thermostable Mutant of Transglutaminase by Streptomyces mobaraensis”（Ye et al.,J.Agric.Food Chem.,2024.72(8):4207-4216.）。2021級碩士葉佳才為論文第一作者，劉松研究員為通訊作者，論文作者還包括周景文教授和堵國成教授。
谷氨酰胺轉氨酶（EC 2.3.2.13，TGase）能夠催化蛋白質發生共價交聯，廣泛應用于肉制品、乳制品和豆制品等蛋白基食品的質構改良，并在制藥、紡織和皮革等非食品領域具有良好的應用前景。茂原鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）食品添加劑國家標準GB2760規定的TGase生產菌株，是商品TGase的主要來源。然而，天然S.mobaraensis TGase熱穩定性差，應用領域受限。前期研究中，本團隊對S.mobaraensis TGase進行了理性改造，得到的突變體TGm2 60℃半衰期較野生酶提高33.45倍（J.Agric.FoodChem.,2021,69:15268?15278）。
然而，上述研究中TGm2只在大腸桿菌中進行少量合成，并不適于工業化生產。因此，實現耐熱TGase在食品安全菌株S.mobaraensis中的高效合成十分迫切。
針對上述問題，本研究團隊結合隨機誘變及定點基因整合在S.mobaraensis中高效合成了TGase耐熱突變體TGm2。首先，對S.mobaraensis DSM40587進行ARTP誘變，篩選到一株TGase產量增加12.2倍的突變體smY2022，并確定了啟動子核心區域（“-10區”G->A）的突變是導致其高產的重要原因。然后，優化了同源臂的長度提高了S.mobaraensis基因組中雙交換同源重組的效率，并將smY2022中野生型TGase的編碼序列替換為耐熱突變體TGm2的基因，得到重組菌株smY2022-TGm2，胞外TGase活性達到61.7 U/mL，是目前報道的TGase酶活最高的S.mobaraensis菌株。進一步對TGm2的催化性能進行了表征。在60°C時，TGm2的半衰期和比活性分別達到64 min和71.15 U/mg，分別是野生型TGase的35.6倍和2.9倍。進一步比較了野生型TGase和TGm2對大豆分離蛋白、酪蛋白、乳清蛋白及牛血清蛋白的交聯能力。結果表明這2種酶在40°C時具有相似的能力，但TGm2在70°C時表現出明顯優于野生型TGase的蛋白交聯能力。上述結果表明，smY2022-TGm2能夠高效合成耐熱TGase，具有良好的工業化應用前言。
利用ARTP反復誘變茂源鏈霉菌提高谷氨酰胺轉氨酶產量
本期向您推薦華東理工大學許建和教授、李春秀副教授科研團隊，采用ARTP誘變育種技術處理茂源鏈霉菌，通過8輪ARTP誘變，獲得多株高產谷氨酰胺轉氨酶（TGase）高產突變株，其中突變株Sm5-V1 TGase產量達到5.85 U/mL。該研究成果于2017年發表在《Bioresources and Bioprocessing》上（題目：Enhancing transglutaminase production of Streptomyces mobaraensis by iterative mutagenesis breeding with atmospheric and room?temperature plasma(ARTP)）。
谷氨酰胺轉氨酶(TG酶)又稱為蛋白質-谷氨酸-γ-谷氨酰胺轉氨酶，能夠催化蛋白質分子之間或之內的交聯、蛋白質和氨基酸之間的連接以及蛋白質分子內谷氨酰胺殘基的水解，從而改善蛋白質的結構和功能。因此，在食品、醫藥等領域有廣闊的應用前景。目前，應用在食品工業領域的谷氨酰胺轉氨酶主要由茂源鏈霉菌發酵生產。鑒于食品上對基因工程菌的限制，因此用誘變的方法選育TG酶高產菌株。
許建和教授、李春秀副教授科研團隊利用ARTP技術對茂源鏈霉菌ECU7480進行8輪誘變處理，共選擇了501個突變株進行試管發酵篩選，研究多次反復誘變對TGase產量提升的累積效應。通過統計學分析得出結論，菌株的正突變率隨著誘變次數的增加而升高，而且最佳突變株TGase的產量也隨著反復誘變次數增多呈現波動性提升的趨勢。最終，選育出四株高產菌株Sm5-V1,Sm6-V13,Sm2-V10,and Sm7-V12,其中Sm5-V1 TGase產量比出發菌株提升27%，達到5.85 U/mL，經過8代遺傳后仍然保持穩定。充分證明ARTP作為一種新型誘變手段，是工業育種的良好工具。
通過實時定量PCR分析和基因測序研究得出，與出發菌株分泌的TG酶相比，高產突變株TG酶酶原的結構基因pro-smtg核苷酸序列并沒有發生改變，但pro-smtg的表達水平明顯提升，這可能是TG酶產量提高的原因。本研究針對目標基因序列和轉錄水平的分析，為進一步研究ARTP誘變產生的代謝過程的改變提供了重要的指導。