豨薟草果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定、生長(zhǎng)特性、抑菌效果及藥敏分析（一）
豨薟草有多種藥用價(jià)值，旨在從豨薟草果實(shí)中分離和篩選出高拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌。采用了形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rRNA序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析以及OD600值、藥敏試驗(yàn)和超濾等方法對(duì)該抗感染細(xì)菌C-5-1進(jìn)行了相關(guān)生物學(xué)特性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，C-5-1為側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus），對(duì)多種病原細(xì)菌均敏感，尤其是對(duì)銅綠假單胞菌；低pH和高NaCl鹽度環(huán)境中耐受性有限，在pH≤5.0或鹽度≥15%時(shí)其生長(zhǎng)受到了完全的抑制甚至是死亡，但在pH范圍7.0-11.0和鹽度范圍0-5%下均能生長(zhǎng)良好，說(shuō)明該菌株為耐堿，但不耐酸和鹽；篩選出了對(duì)菌株C-5-1高度敏感而對(duì)5種指示病原菌耐藥的抗生素，即氨芐西林；C-5-1發(fā)酵上清液中存在著兩種抗菌物質(zhì)，且它們的相對(duì)分子質(zhì)量均小于2 000。因此豨薟草有著優(yōu)良微生物資源，可以成為開(kāi)發(fā)抗感染細(xì)菌藥物的重要資源。
微生物已經(jīng)成為新型抗感染藥物的重要來(lái)源之一。并且隨著分離技術(shù)的不斷進(jìn)步，分離水平的不斷發(fā)展，更多的微生物可能會(huì)被人類發(fā)現(xiàn)利用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌存在于各種藥用植物中，菌株分布廣種類多，且在與宿主長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，形成了產(chǎn)生某些與宿主植物有著相同或者相似藥用價(jià)值能力的化合物。因此，藥用植物內(nèi)生菌是一類具有重大開(kāi)發(fā)潛力的微生物資源。
豨薟草為菊科植物的干燥地上部分，味苦、辛，性寒，小毒，歸肝腎經(jīng)，可以祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、清熱解毒，治風(fēng)濕痹痛、筋骨不利、腰膝無(wú)力、半身不遂、高血壓、瘧疾、黃疸、癰腫瘡毒、風(fēng)疹濕瘡、蟲(chóng)獸咬傷。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)豨薟草的研究越來(lái)越重視，但有關(guān)其內(nèi)生菌資源的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。
本研究以豨薟草中篩選分離得到的具有抗感染活性的內(nèi)生細(xì)菌菌株為研究對(duì)象，并闡述其相關(guān)生物學(xué)特性，旨在為進(jìn)一步研究該菌株的抗感染代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1藥用植物
所用材料為無(wú)病蟲(chóng)害、剛成熟的豨薟草果實(shí)，采自河南省洛陽(yáng)市汝陽(yáng)縣峴山。
1.1.2指示菌
5種病原細(xì)菌均由河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供。
1.1.3主要試劑
實(shí)驗(yàn)中使用的PCR酶和DNA Marker購(gòu)自大連寶生物公司；兩性霉素B購(gòu)自上海生工；7種藥敏片（濃度均為30μg/片）購(gòu)自北京賽為思生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心；微量生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；其他化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。
1.1.4培養(yǎng)基組分
內(nèi)生細(xì)菌分離采用改進(jìn)的LB瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，葡萄糖5，瓊脂粉20。液體發(fā)酵采用改進(jìn)的LB液體培養(yǎng)基。為抑制真菌生長(zhǎng)，以上培養(yǎng)基使用前，均需加入終濃度為50μg/mL的兩性霉素B（用二甲基亞砜溶解）。
1.2方法
區(qū)域內(nèi)出露的地層主要為太古界太華群、中元古界長(zhǎng)城系熊耳群、薊縣系高山河群、新元古界官道口群、中生界白堊系、新生界古近系、新近系和第四系等，其中太古界太華群在區(qū)域北部出露，構(gòu)成本區(qū)古老的結(jié)晶基底，主要由一套變質(zhì)達(dá)角閃巖相的中深變質(zhì)巖及少量混合巖組成，為本區(qū)金礦物質(zhì)的主要來(lái)源之一。
1.2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化
內(nèi)生細(xì)菌的分離是通過(guò)組織表面消毒來(lái)去除表生菌，具體操作如下：取新鮮豨薟草果實(shí)，用自來(lái)水洗凈，消毒紙吸干，滅菌刀片去皮，然后用無(wú)菌水再清洗一遍，接著用75%乙醇浸泡3 min后，用0.1%氯化汞漂洗1-2 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次并吸干。將消毒后的果實(shí)切成6 mm大小的組織塊，種植于LB瓊脂平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24 h，挑取少許劃線接種到新的LB瓊脂培養(yǎng)基上，反復(fù)純化至單一純菌落，置于4℃冰箱保存待用。為檢測(cè)試驗(yàn)材料表面是否徹底消毒，取以上最后1次無(wú)菌水沖洗液涂布于LB平板上，于同等條件下培養(yǎng)作為對(duì)照，如對(duì)照平板無(wú)菌落長(zhǎng)出即表明消毒徹底，后續(xù)試驗(yàn)所分離到的細(xì)菌來(lái)自果實(shí)內(nèi)部，即為內(nèi)生菌。
1.2.2拮抗細(xì)菌的篩選
以病源細(xì)菌——金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌為指示菌，采用平板對(duì)峙法，每一種待測(cè)純菌落需做3次重復(fù)。無(wú)菌條件下，取100μL指示菌懸液（1×107CFU/mL）均勻涂布于LB平板上，將每個(gè)平板均分成4等份，20 min后將直徑約為6 mm的待測(cè)菌塊（瓊脂）貼附于指示菌平板中央（每一等份），37℃培養(yǎng)24 h，觀察各培養(yǎng)板指示菌的生長(zhǎng)狀況及抑菌圈大?。ò鷫K直徑6 mm，下同），同時(shí)作陽(yáng)性對(duì)照（以氯霉素藥片代替菌塊）。各菌株拮抗效果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑＞15 mm為高度敏感，抑菌圈直徑11-15 mm為中度敏感，抑菌圈直徑7-10 mm為低度敏感，無(wú)抑菌圈者為不敏感。
1.2.3菌種鑒定
（1）形態(tài)學(xué)鑒定：參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，革蘭氏染色和芽孢染色光學(xué)顯微鏡鏡檢，記錄其顯微形態(tài)。（2）生理生化鑒定：參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)測(cè)定（微量生化鑒定管）。（3）分子鑒定：將待測(cè)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，CTAB法提取基因組，細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'）對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行序列相似性分析，再利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。
1.2.4藥敏試驗(yàn)
為了后續(xù)試驗(yàn)的開(kāi)展，本研究需要對(duì)待測(cè)菌和5種指示菌做藥敏試驗(yàn)。結(jié)合指示菌的臨床藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選取了6種藥敏片，即頭孢他啶、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、氨芐西林、青霉素以及四環(huán)素。
1.2.5生長(zhǎng)特性分析
待測(cè)菌經(jīng)LB液體活化3次，取活化好的種子液以1%的接種量分別接種到不同pH梯度（3.0、5.0、7.0、9.0、10.0和11.0）和NaCl濃度（1%、2%、5%、10%、15%和20%）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h后，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以上每個(gè)梯度分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)（為了滿足所測(cè)得的吸光度值與細(xì)菌濃度成線性比例關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)首先將不同梯度下的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋至OD600=0.3-0.7，然后將所測(cè)得的具體數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為該梯度下的OD600值）。
1.2.6抗菌代謝產(chǎn)物的初步純化
將待測(cè)菌株接入LB液體培養(yǎng)基中（50 mL），30℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)離心（8 000 r/min，10 min）去除菌體得上清，然后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相和水相分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用2 mL無(wú)菌水將其溶解，取200μL測(cè)量對(duì)指示菌的拮抗活性，重復(fù)操作3次。將有抗菌活性的水溶液依次經(jīng)過(guò)截留相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為10 kD、5 kD和2 kD的超濾離心管，4℃，12 000 r/min下離心30 min，分別收集相應(yīng)的濾出液及截留液，放入-70℃冰箱凍存，并進(jìn)行冷凍干燥，得到的冷凍干燥粉末-70℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们霸賹⒏稍锓勰┘尤胫? mL無(wú)菌水，分別獲得濾出液及截留液。
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