快速藥敏檢測方法、發(fā)展現(xiàn)狀|拉曼光譜在RAST領(lǐng)域中的應(yīng)用（二）
3拉曼光譜技術(shù)在RAST領(lǐng)域中的應(yīng)用
3.1基于單細(xì)菌分子表型的RAST
基于單細(xì)菌分子表型的RAST可以省去細(xì)菌增殖所需時(shí)間。目前,基于單細(xì)胞水平的快速分子表型的藥敏檢測,主要依賴于活細(xì)菌對重水(D2O)的代謝攝入,生成細(xì)菌內(nèi)部的生物分子,比如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等,通過檢測C-D峰的強(qiáng)度可以實(shí)現(xiàn)抗菌藥物MIC的快速檢測。
C-D峰位于拉曼光譜的2 040～2 300 cm-1波段,該波段通常在未進(jìn)行D2O標(biāo)記的細(xì)菌中無可檢測到的拉曼峰,具有高特異性。見圖1。此外,在含有D2O的培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌C-D峰的強(qiáng)度變化與活細(xì)菌的代謝活性呈正相關(guān)。
圖1銅綠假單胞菌在正常和含D2O的培養(yǎng)基中培養(yǎng)
任何活細(xì)菌的代謝都需要水,因此,在含有D2O的培養(yǎng)基中生長的活細(xì)菌都會(huì)生成代謝表征的C-D峰,這決定了C-D峰可作為分辨單細(xì)菌細(xì)胞代謝活動(dòng)的通用生物標(biāo)志物。在基于培養(yǎng)的藥敏檢測方法中,細(xì)菌增殖一代的時(shí)間比開始出現(xiàn)代謝表征的時(shí)間長,而且不同種細(xì)菌的生長時(shí)間差異也會(huì)使藥敏時(shí)間難以縮短,因此,基于C-D峰的單細(xì)胞拉曼藥敏檢測方法在RAST領(lǐng)域中有著極好的應(yīng)用前景。
在目前的研究中,運(yùn)用單細(xì)胞拉曼技術(shù)進(jìn)行MIC的快速測定大致分為3步:(1)細(xì)菌在含有不同濃度梯度抗菌藥物的培養(yǎng)基中先孵育1～2 h;(2)按體積比向培養(yǎng)基中加入D2O(目前報(bào)道30%～100%D2O濃度),同時(shí)保證培養(yǎng)基濃度和藥物濃度與初始一致,繼續(xù)孵育30 min左右;(3)根據(jù)耐藥組和敏感組的相對C-D比,即C-D/(C-H+C-D)來設(shè)定cut off值以測定MIC。
3.1.1運(yùn)用CRS技術(shù)進(jìn)行RAST
TAO等證明了基于D2O活菌代謝標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼光譜可以檢測細(xì)菌對抗菌藥物的反應(yīng),2 040～2 300 cm-1波段的C-D拉曼帶可作為單細(xì)菌代謝活性的通用生物標(biāo)志物。YANG等開發(fā)了適用于臨床尿液標(biāo)本直接藥敏檢測的單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù),基于活菌的D2O代謝摻入,通過相對C-D比設(shè)置S/R截止值用于藥敏結(jié)果判讀,達(dá)到了從接收尿液標(biāo)本到結(jié)果讀取總檢測時(shí)間縮短至2.5 h,且準(zhǔn)確度高的效果。YUAN等將31株伊麗莎白菌分別與8種不同濃度抗菌藥物和40%D2O共孵育,4 h即可測定抗菌藥物的MIC,除頭孢吡肟外,其他7種抗菌藥物的單細(xì)胞拉曼藥敏結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)藥敏結(jié)果一致率為94%。在該研究中,頭孢吡肟所測藥敏結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致可能是因?yàn)椴簧L但代謝活躍的細(xì)菌存在,這種特性可能會(huì)影響藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確性,也會(huì)成為細(xì)菌感染治療后復(fù)發(fā)的根源。因此,臨床可以通過單細(xì)胞拉曼藥敏檢測技術(shù)來評(píng)估抗菌藥物療效,更好地指導(dǎo)臨床給藥。
3.1.2運(yùn)用SRS技術(shù)進(jìn)行RAST
快速準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)對于多藥耐藥菌的安全、有效和環(huán)境友好型治療至關(guān)重要。ZHANG等利用飛秒受激拉曼散射成像對經(jīng)過70%D2O培養(yǎng)基和不同濃度抗菌藥物孵育后的細(xì)菌進(jìn)行單細(xì)胞成像,在不到2.5 h測定了14種抗菌藥物對臨床常見8種病原菌的MIC值,與金標(biāo)準(zhǔn)藥敏結(jié)果的符合率為94.6%。此外,該研究制備了模擬尿液和血液標(biāo)本,通過直接過濾的方法分離細(xì)菌進(jìn)行藥敏檢測,準(zhǔn)確度良好。此外,ZHANG等在單細(xì)胞水平上,通過SRS成像監(jiān)測抗菌藥物作用下的D2O活菌代謝摻入,在2.5 h內(nèi)測得抗菌藥物的單細(xì)胞代謝失活濃度。該方法還適用于尿液或血液等復(fù)雜生物標(biāo)本的直接RAST。
3.2基于多細(xì)菌分子表型的RAST
雖然基于單細(xì)菌分子表型的RAST方法具有一定優(yōu)勢,但由于細(xì)菌是活體,同種菌的不同個(gè)體狀態(tài)在不同時(shí)間或空間可能不同,這會(huì)影響藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,有研究者開發(fā)了基于多細(xì)胞水平分子表型檢測的RAST方法,這種方法主要依賴于SERS技術(shù)。CHANG等開發(fā)了集成膜過濾和SERS活性襯底的微流控系統(tǒng),微通道內(nèi)腔室的膜可過濾和濃集細(xì)菌,注射泵將培養(yǎng)基、抗菌藥物和洗滌液等注入其中,在過濾室中培養(yǎng)細(xì)菌,細(xì)菌釋放的代謝物被輸送到附著SERS襯底的微通道中進(jìn)行檢測,藥敏檢測時(shí)間明顯縮短。FU等篩得一種帶負(fù)電荷的適配子,與細(xì)菌特異性結(jié)合,利用粗糙金屬納米顆粒的信號(hào)放大作用,測定了大腸埃希菌O157∶H7和金黃色葡萄球菌在不同濃度抗菌藥物作用下的拉曼光譜,首次發(fā)現(xiàn)735 cm-1可作為標(biāo)志峰位置,基于此峰強(qiáng)度的變化,在1 h內(nèi)可測得藥物的MIC。HILTON等將納米銀顆粒印在SERS紙傳感器上,利用便攜式拉曼光譜儀對不同β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的大腸埃希菌進(jìn)行檢測,在2.5 h內(nèi)即可完成大腸埃希菌的耐藥分析。新型RAST技術(shù)匯總見表1。
表1新型RAST技術(shù)匯總
4結(jié)論與展望
基于細(xì)菌生長和代謝表型的RAST技術(shù)相較于傳統(tǒng)藥敏方法的檢測時(shí)間明顯縮短,其中,運(yùn)用拉曼光譜技術(shù)在細(xì)菌代謝表型水平進(jìn)行RAST具有很好的應(yīng)用前景。
雖然微流控、電阻抗和SYBR GreenⅠ活菌染色等技術(shù)平均藥敏檢測時(shí)間為1 h左右,但適用的細(xì)菌和抗菌藥物都比較局限,也無法識(shí)別菌群中的異耐藥菌,而且檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性缺乏大標(biāo)本量的驗(yàn)證。此外,這些基于生長的藥敏檢測對細(xì)菌的初始接種量有要求,而且細(xì)菌在剛接種到培養(yǎng)基中會(huì)經(jīng)歷1～3 h的遲緩期,很難檢測到數(shù)量上的微弱變化,還易受到細(xì)菌本身狀態(tài)和環(huán)境等因素的影響。
基于RNA測序的藥敏檢測目前只對環(huán)丙沙星作用于大腸埃希菌有研究,雖然其屬于細(xì)菌代謝表型檢測的RAST,但操作復(fù)雜,初始菌量要求高,難以滿足臨床要求。基于單細(xì)菌和多細(xì)菌代謝表型的RAST技術(shù)準(zhǔn)確度高、靈敏度高,但仍有許多不足之處:(1)缺乏大規(guī)模臨床分離株和抗菌藥物的驗(yàn)證;(2)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程、不能做質(zhì)控和室間比對等;(3)細(xì)菌個(gè)體的異質(zhì)性會(huì)影響單細(xì)菌藥敏檢測的準(zhǔn)確性;(4)對于SERS的藥敏檢測,增強(qiáng)基底合成復(fù)雜,容易受到殘留培養(yǎng)基和其他成分的干擾,可重復(fù)性低等;(5)適用的標(biāo)本類型局限于純培養(yǎng)菌落、尿液和全血標(biāo)本,而對于復(fù)雜的痰液、糞便等標(biāo)本的直接藥敏檢測鮮有研究。
未來還需要對基于細(xì)菌生長和代謝表型檢測的RAST技術(shù)進(jìn)行大量的臨床分離株和抗菌藥物驗(yàn)證,并對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估;其次是標(biāo)本處理流程的標(biāo)準(zhǔn)化,做好質(zhì)控和室間比對,提高檢測的可重復(fù)性和臨床適用性;進(jìn)行拉曼光譜藥敏檢測時(shí)要引入合適的內(nèi)標(biāo),消除復(fù)雜因素對檢測的影響,也可以將拉曼光譜與電阻抗、微流控、化學(xué)染色等技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)更快、更準(zhǔn)確、重復(fù)性更好的RAST方法,實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜標(biāo)本中直接進(jìn)行細(xì)菌快速鑒定及藥敏檢測。
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