細(xì)菌懸液中活菌濃度的檢測(cè)方法：平板點(diǎn)樣技術(shù)VS傳統(tǒng)平板涂布法
[摘要]目的比較平板點(diǎn)樣法與傳統(tǒng)平板涂布計(jì)數(shù)法，建立更為簡(jiǎn)便的細(xì)菌懸液中活菌濃度的檢測(cè)方法。方法將3株A群溶血性鏈球菌制備成多份菌懸液，稀釋成不同梯度，用調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)中的平板點(diǎn)樣技術(shù)和傳統(tǒng)平板涂布法同時(shí)檢測(cè)，比較兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果，分析相關(guān)性和顯著差異。結(jié)果不同菌株和稀釋方法中平板點(diǎn)樣法的結(jié)果均隨菌液稀釋梯度呈現(xiàn)出較好的梯度；兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果呈高度相關(guān)（r=0.84）；二者的t檢驗(yàn)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論相對(duì)平板涂布法，平板點(diǎn)樣法計(jì)數(shù)更客觀準(zhǔn)確，檢測(cè)范圍更寬，操作更便捷，適用于菌液濃度的確定。
在臨床細(xì)菌診斷試劑盒的評(píng)價(jià)過程中，菌液濃度的確定是參考品制備的關(guān)鍵步驟，因此菌液濃度的測(cè)定方法應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確、便捷。目前，菌液濃度的測(cè)定和參考品的制備常用濁度法（包括比濁法、分光光度法等）和平皿計(jì)數(shù)法，但濁度法難以區(qū)分活菌與死菌，以及與微生物大小類似的雜質(zhì)。傳統(tǒng)用于測(cè)定菌液內(nèi)活菌量的方法主要是平板涂布法。此方法雖結(jié)果較為準(zhǔn)確，但可計(jì)數(shù)濃度范圍窄，且人眼計(jì)數(shù)不夠客觀；操作復(fù)雜，所需時(shí)間較長(zhǎng)，當(dāng)制備大批量參考品時(shí)，其計(jì)數(shù)工作量也變得不可忽視，更易因疲勞而使誤差變大。
平板點(diǎn)樣計(jì)數(shù)法是調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)（opsonophagocytic assay，OPA）中的細(xì)菌濃度檢測(cè)方法。調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)是評(píng)估肺炎球菌疫苗效價(jià)的實(shí)驗(yàn)方法，其原理是用肺炎球菌疫苗免疫后的血清樣本（抗體）、HL-60細(xì)胞和補(bǔ)體構(gòu)建體外型別特異性抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬模型，對(duì)一定濃度的肺炎鏈球菌進(jìn)行清除，之后通過檢測(cè)體系中存活肺炎鏈球菌的濃度計(jì)算出血清樣本中的功能抗體活力，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺炎球菌疫苗保護(hù)效力的準(zhǔn)確評(píng)估。近年來，美國阿拉巴馬大學(xué)通過長(zhǎng)期探索，建立了優(yōu)化的多重調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同時(shí)對(duì)4種血清型的肺炎球菌功能抗體進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了工作量并節(jié)約血清樣本，更使得OPA技術(shù)的檢測(cè)通量成倍提高。此實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確高效，被WHO推薦用于肺炎球菌疫苗的功能性抗體檢測(cè)，且國外部分藥企已經(jīng)開始采用。其中檢測(cè)存活肺炎球菌濃度所用的平板點(diǎn)樣方法是該實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)高效便捷的關(guān)鍵步驟。
在目前申報(bào)檢驗(yàn)的臨床細(xì)菌診斷試劑盒中，A群鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒申報(bào)較多、應(yīng)用較廣，且A群鏈球菌與肺炎球菌寄生部位接近，培養(yǎng)條件較相似。因此本實(shí)驗(yàn)選用A群鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒的國家參考菌株制備懸液，參考調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)中平板點(diǎn)樣的方法，同時(shí)與傳統(tǒng)平板涂布法比較驗(yàn)證，建立一種更快速簡(jiǎn)便的活菌濃度檢測(cè)法。
1材料與方法
1.1一般材料
菌株是由中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供A群溶血性鏈球菌CMCC32300、CMCC32301、CMCC32067。試劑是注射用生理鹽水；MH培養(yǎng)基（Bacto）、羊血（陸橋公司）；Todd-Hewitt Broth（Bacto）、酵母提取物（Bacto）、瓊脂（Bacto）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑TTC（Amresco）、水。培養(yǎng)基為10%羊血培養(yǎng)基：MH培養(yǎng)基10.5 g；水500 mL；在使用前融化培養(yǎng)基，溫度冷卻至50～60℃時(shí)加入羊血50 mL混勻。THYA培養(yǎng)基：Todd-Hewitt Broth培養(yǎng)基12 g；酵母提取物2 g；瓊脂6 g；水500 mL。上層培養(yǎng)基：Todd-Hewitt Broth培養(yǎng)基24 g；酵母提取物4 g；瓊脂6 g；水800 mL。TTC儲(chǔ)液：TTC 1.25 g；水50 mL，用0.22μm濾膜過濾除菌后，于4℃保存。溶液呈淡黃色；若顏色變紅，廢棄，重新制備。
1.2儀器
電子天平（ME204）購自瑞士METTLER TOLEDO儀器（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（LRH-250-Ⅱ）購自廣東省醫(yī)療器械廠；恒溫水浴鍋（XMTD-6000）購自北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；超凈工作臺(tái)（SG-603TX）購自BAKER公司；立體菌落計(jì)數(shù)儀購自丹麥Biosense公司；顯微鏡（BX51）購自日本OLYMPUS公司；振蕩器（QL-901）購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。
1.3樣品制備
1.3.1菌懸液制備將A群溶血性鏈球菌CMCC32067、CMCC32300、CMCC32301凍干粉復(fù)蘇后，制成懸液涂布在羊血培養(yǎng)基平板上，在37℃過夜培養(yǎng)。將平板上的菌體刮至10 mL注射用生理鹽水中，制成均一菌懸液。
1.3.2梯度稀釋將CMCC32067制備7份菌懸液，將其中5份進(jìn)行1/10系列稀釋8個(gè)梯度，另外2份做1/2系列稀釋18個(gè)梯度；將CMCC32300和CMCC32301各制備1份菌懸液，并進(jìn)行1/10系列稀釋8個(gè)梯度。
1.4平板點(diǎn)樣
1.4.1培養(yǎng)基準(zhǔn)備將THYA培養(yǎng)基融化后，倒于13 cm×13 cm方形培養(yǎng)皿中，25 mL/板；凝固后在超凈臺(tái)內(nèi)開蓋吹30～45 min，備用。將上層培養(yǎng)基融化后保存于50℃水浴中1～2 h，確保溫度至50℃，備用。
1.4.2平板點(diǎn)樣1/10梯度稀釋每個(gè)濃度菌液以及1/2梯度稀釋的后8個(gè)濃度的菌液，分別取10μL滴在THYA方形培養(yǎng)皿左側(cè)，每點(diǎn)完一個(gè)樣品立即傾斜平板，使菌液滴流成2～3 cm長(zhǎng)，每個(gè)梯度做兩個(gè)平行。待所有樣品點(diǎn)完后，室溫放置20～30 min，讓菌液吸收到瓊脂板上。從水浴中取出上層培養(yǎng)基，取25 mL入25μL TTC儲(chǔ)液混勻，從板子邊緣緩慢傾倒在點(diǎn)樣的THYA平板上。待上層培養(yǎng)凝固，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)過夜，
1.4.3菌落計(jì)數(shù)用菌落計(jì)數(shù)儀統(tǒng)計(jì)每個(gè)點(diǎn)樣條的菌落數(shù)。
1.5平板涂布
分別取各系列菌液中的部分梯度50μL或100μL菌液均勻涂布于羊血平板，各做兩個(gè)平行，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)過夜，手動(dòng)計(jì)數(shù)。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
將7份菌懸液的各稀釋梯度用兩種平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，再用各個(gè)梯度的計(jì)數(shù)結(jié)果分別折算出初始濃度，采用SPSS 13.0對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析和成對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2、結(jié)果與討論
在本實(shí)驗(yàn)中，用不同菌株、不同稀釋方法且多次重復(fù)試驗(yàn)，平板點(diǎn)樣法的結(jié)果均隨菌液稀釋梯度呈現(xiàn)出較好的梯度。比較了平板點(diǎn)樣法與平板涂布法計(jì)數(shù)7份CMCC32067的菌懸液的不同濃度梯度，以及不同的血平板點(diǎn)樣量，結(jié)果均顯示出高度相關(guān)性，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用兩種平板計(jì)數(shù)方法計(jì)算另外兩株A群溶血性鏈球菌菌液濃度，同樣具有較好的一致性。比較兩種計(jì)數(shù)方法的操作性和準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)平板點(diǎn)樣法點(diǎn)樣區(qū)域小、點(diǎn)樣量少，計(jì)數(shù)簡(jiǎn)便，因而可檢測(cè)的濃度范圍比平板涂布法較寬。
用多個(gè)稀釋度的濃度檢測(cè)結(jié)果計(jì)算初始菌液濃度顯示，測(cè)定結(jié)果隨稀釋度提高略有升高，分析原因可能為：①存在稀釋過程中的操作誤差；②點(diǎn)樣區(qū)域有限，在稀釋度低時(shí)菌液濃度高，菌落密集且大小不均，容易漏計(jì)或合并計(jì)數(shù)，造成計(jì)算結(jié)果偏低；高稀釋度時(shí)菌液濃度低，菌體可能未落在點(diǎn)樣區(qū)域，造成平行孔之間CV值較大，濃度計(jì)算不準(zhǔn)確。根據(jù)結(jié)果分析，選擇菌落數(shù)在20～100個(gè)之間的點(diǎn)樣區(qū)計(jì)算菌液濃度的偏差較小，點(diǎn)樣濃度最好在2×104～2×102 cfu/mL，將同一菌液的多個(gè)梯度的計(jì)數(shù)結(jié)果平均，計(jì)算初始菌液濃度更為準(zhǔn)確。
由于平板點(diǎn)樣法所需樣品量少、點(diǎn)樣區(qū)域小，可以在一塊方形培養(yǎng)皿里同時(shí)檢測(cè)多個(gè)稀釋度或多種菌液。若待檢樣品多，還可以將初始菌懸液用移液器在96孔板中梯度稀釋后，再用多道移液器同時(shí)點(diǎn)樣多個(gè)梯度或多種菌液，操作更加便捷。且此方法用儀器自動(dòng)計(jì)數(shù)，并且可以根據(jù)情況進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整，準(zhǔn)確度和效率更高，減少了傳統(tǒng)平板涂布法的涂布不均和人眼計(jì)數(shù)誤差。
對(duì)于其他細(xì)菌檢測(cè)試劑盒，當(dāng)制備試劑盒評(píng)價(jià)參考品時(shí)，如果其抗原菌株不能在THYA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如淋病奈瑟菌等，在測(cè)定參考品濃度時(shí)可篩選出適宜其生長(zhǎng)的且透明度好的培養(yǎng)基點(diǎn)樣，以便于TTC顯色后用儀器計(jì)數(shù)，這部分研究將在本室的后續(xù)工作中進(jìn)行。
綜上所述，相較于平板涂布法，用平板點(diǎn)樣法檢測(cè)菌液濃度更加快捷，簡(jiǎn)便，上樣量少，且檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確客觀，檢測(cè)范圍寬，平均多個(gè)梯度后計(jì)算更加縮小了誤差，可以用于大批量試劑盒參考品的制備。
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