空腸彎曲菌噬菌體生物學特性測定及生長曲線繪制（一）
空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是一種革蘭氏陰性微需氧細菌，屬于彎曲菌屬，是一種典型的食源性人畜共患病原菌，被認為是引發細菌性急性腹瀉的主要原因。世界衛生組織統計，空腸彎曲菌每年在全球造成3.7萬多人死亡，與空腸彎曲菌相關的食物中毒病例在持續上升。除了引發腸胃炎，對于免疫力低下的人群，感染空腸彎曲菌可導致格林-巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)，容易造成呼吸肌麻痹而死亡，進一步的空腸彎曲菌感染后遺癥是關節炎、結節性紅斑等。禽類是空腸彎曲菌的主要宿主。空腸彎曲菌在肉雞群中的定植率為30%～90%，在3周齡以上的雞群中定植率最高。此外，空腸彎曲菌還可能污染生豬肉、牛肉、羊肉、蔬菜、水果、牛奶等。根據最新報道，空腸彎曲菌對氟喹諾酮類藥物、四環素、紅霉素、慶大霉素等抗生素均具有抗藥性，因此世界衛生組織將其列為重要的耐藥細菌，為了有效防治空腸彎曲菌的污染和耐藥性，開發新型抗菌劑尤為迫切。
噬菌體是一種細菌病毒，它能夠通過尾絲蛋白識別細菌表面的特定受體，從而特異性地識別宿主菌，并在其體內復制，最終裂解宿主菌。噬菌體具有顯著的特異性、增殖迅速、強大的抗菌能力，而且不會對其他正常菌群產生影響，因此噬菌體已成為一種廣受關注的新型抗菌劑。目前彎曲菌噬菌體大多數是從家禽的腸道或排泄物中分離，主要分為3組:Ⅰ組包含極少數具有大基因組的噬菌體(約320～425 kbp)，Ⅱ組基因組大小介于180～190 kbp，Ⅲ組介于130～140 kbp。Ⅲ組噬菌體的裂解能力更強，在防治彎曲菌污染方面具有更大的優勢。空腸彎曲菌特異性噬菌體可用于家禽養殖場，以防止或減少彎曲菌在家禽中的定植。CARVALHO等發現空腸彎曲菌噬菌體雞尾酒通過口服灌胃和飼料給藥時，空腸彎曲菌的數量減少約為2 lg CFU/g;LOC CARRILLO等發現與未處理的對照組相比，在噬菌體給藥后5 d內，鳥類盲腸內容物中空腸彎曲菌的數量下降0.55 lg CFU/g。目前只有16個彎曲菌噬菌體完成了全基因組測序，對空腸彎曲菌噬菌體進行生物學表征和基因組學分析的研究十分有限，關于空腸彎曲菌噬菌體用于防控家禽生產中彎曲菌污染的專利也很少，因此需要開發更豐富的空腸彎曲菌噬菌體資源，并對其進行表征和測序，是當前彎曲菌噬菌體研究的重點。
本研究從青島家禽養殖場雞糞樣品中分離一株裂解性的空腸彎曲菌噬菌體，對其進行生物學特性測定、全基因組分析及進化分析等，為空腸彎曲菌噬菌體的研究和應用提供理論基礎，為防控空腸彎曲菌污染和耐藥性提供參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1菌株
空腸彎曲菌2206(Campylobacterjejuni2206)由青島潤達生物科技有限公司惠贈;空腸彎曲菌CICC 22936(CampylobacterjejuniCICC 22936)、沙門氏菌14028(Salmonella14028)、銅綠假單胞菌PA01(Pseudomonasaeruginosa01)、銅綠假單胞菌PA14(Pseudomonasaeruginosa14)、枯草芽孢桿菌WB800(BacillussubtilisWB800)由本實驗室保存并提供。
1.1.2樣品來源
雞糞便樣品采自山東省青島市家禽養殖場。
1.1.3培養基和主要試劑
NZCYM瓊脂培養基、NZCYM Broth，上海生工生物公司;哥倫比亞血瓊脂基礎培養基、脫纖維羊血、MH肉湯，青島海博生物技術有限公司;0.22μm無菌濾膜，美國Millipore公司。SM緩沖液:NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2 g，1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)50 mL，加超純水定容至1 L。1×PBS緩沖液:KH2PO40.2 g，Na2HPO42.17 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g溶解于1 L水中，調節最終pH值為7.4。
1.1.4儀器與設備
2.5 L MGC微需氧產氣包、2.5 L MGC厭氧罐，日本三菱化學株式會社;mLS-3750高溫蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司;Sigma3K15離心機，上海曦瑪離心機有限公司。
1.2空腸彎曲菌的培養及菌液制備
將Campylobacterjejuni2206劃線培養于哥倫比亞血平板，放置微需氧產氣包于MGC厭氧罐42℃培養36～48 h。無菌接種單菌落至含有20 mL MH肉湯的小錐形瓶，42℃微需氧搖床培養24 h至菌液出現渾濁。
1.3噬菌體的分離純化
取適量新鮮的雞糞樣品用SM緩沖液浸泡，放置于4℃冰箱靜置過夜，使樣品中的噬菌體充分溶解到緩沖液中。將混合物在室溫下8 000 r/min離心15 min，通過0.22μm無菌濾膜除菌，即為樣品濾液。取500μL樣品濾液與500μL對數生長期的空腸彎曲菌液混合，靜置20 min，使噬菌體吸附到宿主菌上。將1 mL混合液和4 mL的半固體培養基NZCYM混合在一起，將混合液注入NZCYM固體平板，鋪雙層平板。將其放置在42℃的微需氧環境中培養24 h，觀察噬菌斑的生長狀況。
挑取單個噬菌斑梯度稀釋于SM緩沖液中，鋪雙層平板，將平板放置在42℃微需氧環境中培養24 h。大約純化5～6輪，至平板上噬菌斑的形態一致。
1.4噬菌體的電鏡形態觀察
將10μL噬菌體增殖液滴加到銅網上面，靜置15 min，用濾紙吸去剩余噬菌體溶液，接著滴加10μL 2%磷鎢酸染料液，繼續染色10 min，最后晾干。使用透射電子顯微鏡，觀察噬菌體的形態特征。
1.5噬菌體的生物學性質
1.5.1噬菌體熱穩定性測定
將100μL噬菌體液與900μL SM緩沖液混合，將其分別放入30、40、50、60、70、80℃水浴，分別靜置30、60 min，采用雙層平板法計算噬菌體在各種溫度下的效價，各個溫度條件采用3組平行測試。
1.5.2噬菌體pH穩定性測定
取100μL噬菌體液與900μL不同pH值(2～13)的PBS緩沖液混合，于42℃水浴加熱2 h后，采用雙層平板法測定噬菌體在不同pH緩沖液的效價，每個pH做3組平行。
1.5.3噬菌體最佳感染復數測定
感染復數(multiple of infection，MOI)是指在特定時間內可吸附的噬菌體與宿主菌的比值，是表征裂解性噬菌體侵染能力的一個重要指標。取1 mL對數期的空腸彎曲菌菌液(1.0×107CFU/mL)，分別按照0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、100.000的感染復數比例加入1 mL稀釋不同濃度的噬菌體，在42℃微需氧搖床，120 r/min條件培養6 h。將混合培養物以12 000 r/min離心2 min。取出100μL的上清液，梯度稀釋，然后用雙層平板法測定噬菌體的效價。做3組平行實驗，噬菌體效價最高的一組感染復數即為最佳感染復數。
1.5.4噬菌體一步生長曲線測定
一步生長曲線測定是衡量噬菌體裂解能力的一個重要生物學指標，能夠反映噬菌體潛伏期的長短、裂解量大小等特性。取1 mL對數期的空腸彎曲菌菌液，再加入1 mL效價為1.0×105PFU/mL的噬菌體，按照最佳感染復數(MOI=0.01)，將混合液放入42℃微需氧厭氧罐中，120 r/min孵育20 min，使噬菌體充分吸附到宿主菌上。將混合物離心2 min，棄去上清液，用MH肉湯洗滌2次，將沉淀用MH肉湯重懸加入20 mL MH肉湯中，在42℃的微需氧搖床中以120 r/min的速度進行培養。定時取樣，直至300 min。每30 min取樣1次測定效價，重復3次實驗。以時間為橫坐標，以噬菌體效價的對數值為縱坐標，繪制一步生長曲線。