空腸彎曲菌噬菌體生物學(xué)特性測(cè)定及生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制（一）
空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是一種革蘭氏陰性微需氧細(xì)菌，屬于彎曲菌屬，是一種典型的食源性人畜共患病原菌，被認(rèn)為是引發(fā)細(xì)菌性急性腹瀉的主要原因。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，空腸彎曲菌每年在全球造成3.7萬(wàn)多人死亡，與空腸彎曲菌相關(guān)的食物中毒病例在持續(xù)上升。除了引發(fā)腸胃炎，對(duì)于免疫力低下的人群，感染空腸彎曲菌可導(dǎo)致格林-巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)，容易造成呼吸肌麻痹而死亡，進(jìn)一步的空腸彎曲菌感染后遺癥是關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑等。禽類(lèi)是空腸彎曲菌的主要宿主。空腸彎曲菌在肉雞群中的定植率為30%～90%，在3周齡以上的雞群中定植率最高。此外，空腸彎曲菌還可能污染生豬肉、牛肉、羊肉、蔬菜、水果、牛奶等。根據(jù)最新報(bào)道，空腸彎曲菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素等抗生素均具有抗藥性，因此世界衛(wèi)生組織將其列為重要的耐藥細(xì)菌，為了有效防治空腸彎曲菌的污染和耐藥性，開(kāi)發(fā)新型抗菌劑尤為迫切。
噬菌體是一種細(xì)菌病毒，它能夠通過(guò)尾絲蛋白識(shí)別細(xì)菌表面的特定受體，從而特異性地識(shí)別宿主菌，并在其體內(nèi)復(fù)制，最終裂解宿主菌。噬菌體具有顯著的特異性、增殖迅速、強(qiáng)大的抗菌能力，而且不會(huì)對(duì)其他正常菌群產(chǎn)生影響，因此噬菌體已成為一種廣受關(guān)注的新型抗菌劑。目前彎曲菌噬菌體大多數(shù)是從家禽的腸道或排泄物中分離，主要分為3組:Ⅰ組包含極少數(shù)具有大基因組的噬菌體(約320～425 kbp)，Ⅱ組基因組大小介于180～190 kbp，Ⅲ組介于130～140 kbp。Ⅲ組噬菌體的裂解能力更強(qiáng)，在防治彎曲菌污染方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。空腸彎曲菌特異性噬菌體可用于家禽養(yǎng)殖場(chǎng)，以防止或減少?gòu)澢诩仪葜械亩ㄖ病ARVALHO等發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌噬菌體雞尾酒通過(guò)口服灌胃和飼料給藥時(shí)，空腸彎曲菌的數(shù)量減少約為2 lg CFU/g;LOC CARRILLO等發(fā)現(xiàn)與未處理的對(duì)照組相比，在噬菌體給藥后5 d內(nèi)，鳥(niǎo)類(lèi)盲腸內(nèi)容物中空腸彎曲菌的數(shù)量下降0.55 lg CFU/g。目前只有16個(gè)彎曲菌噬菌體完成了全基因組測(cè)序，對(duì)空腸彎曲菌噬菌體進(jìn)行生物學(xué)表征和基因組學(xué)分析的研究十分有限，關(guān)于空腸彎曲菌噬菌體用于防控家禽生產(chǎn)中彎曲菌污染的專(zhuān)利也很少，因此需要開(kāi)發(fā)更豐富的空腸彎曲菌噬菌體資源，并對(duì)其進(jìn)行表征和測(cè)序，是當(dāng)前彎曲菌噬菌體研究的重點(diǎn)。
本研究從青島家禽養(yǎng)殖場(chǎng)雞糞樣品中分離一株裂解性的空腸彎曲菌噬菌體，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定、全基因組分析及進(jìn)化分析等，為空腸彎曲菌噬菌體的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為防控空腸彎曲菌污染和耐藥性提供參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1菌株
空腸彎曲菌2206(Campylobacterjejuni2206)由青島潤(rùn)達(dá)生物科技有限公司惠贈(zèng);空腸彎曲菌CICC 22936(CampylobacterjejuniCICC 22936)、沙門(mén)氏菌14028(Salmonella14028)、銅綠假單胞菌PA01(Pseudomonasaeruginosa01)、銅綠假單胞菌PA14(Pseudomonasaeruginosa14)、枯草芽孢桿菌WB800(BacillussubtilisWB800)由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。
1.1.2樣品來(lái)源
雞糞便樣品采自山東省青島市家禽養(yǎng)殖場(chǎng)。
1.1.3培養(yǎng)基和主要試劑
NZCYM瓊脂培養(yǎng)基、NZCYM Broth，上海生工生物公司;哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、脫纖維羊血、MH肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司;0.22μm無(wú)菌濾膜，美國(guó)Millipore公司。SM緩沖液:NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2 g，1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)50 mL，加超純水定容至1 L。1×PBS緩沖液:KH2PO40.2 g，Na2HPO42.17 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g溶解于1 L水中，調(diào)節(jié)最終pH值為7.4。
1.1.4儀器與設(shè)備
2.5 L MGC微需氧產(chǎn)氣包、2.5 L MGC厭氧罐，日本三菱化學(xué)株式會(huì)社;mLS-3750高溫蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司;Sigma3K15離心機(jī)，上海曦瑪離心機(jī)有限公司。
1.2空腸彎曲菌的培養(yǎng)及菌液制備
將Campylobacterjejuni2206劃線(xiàn)培養(yǎng)于哥倫比亞血平板，放置微需氧產(chǎn)氣包于MGC厭氧罐42℃培養(yǎng)36～48 h。無(wú)菌接種單菌落至含有20 mL MH肉湯的小錐形瓶，42℃微需氧搖床培養(yǎng)24 h至菌液出現(xiàn)渾濁。
1.3噬菌體的分離純化
取適量新鮮的雞糞樣品用SM緩沖液浸泡，放置于4℃冰箱靜置過(guò)夜，使樣品中的噬菌體充分溶解到緩沖液中。將混合物在室溫下8 000 r/min離心15 min，通過(guò)0.22μm無(wú)菌濾膜除菌，即為樣品濾液。取500μL樣品濾液與500μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空腸彎曲菌液混合，靜置20 min，使噬菌體吸附到宿主菌上。將1 mL混合液和4 mL的半固體培養(yǎng)基NZCYM混合在一起，將混合液注入NZCYM固體平板，鋪雙層平板。將其放置在42℃的微需氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h，觀(guān)察噬菌斑的生長(zhǎng)狀況。
挑取單個(gè)噬菌斑梯度稀釋于SM緩沖液中，鋪雙層平板，將平板放置在42℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h。大約純化5～6輪，至平板上噬菌斑的形態(tài)一致。
1.4噬菌體的電鏡形態(tài)觀(guān)察
將10μL噬菌體增殖液滴加到銅網(wǎng)上面，靜置15 min，用濾紙吸去剩余噬菌體溶液，接著滴加10μL 2%磷鎢酸染料液，繼續(xù)染色10 min，最后晾干。使用透射電子顯微鏡，觀(guān)察噬菌體的形態(tài)特征。
1.5噬菌體的生物學(xué)性質(zhì)
1.5.1噬菌體熱穩(wěn)定性測(cè)定
將100μL噬菌體液與900μL SM緩沖液混合，將其分別放入30、40、50、60、70、80℃水浴，分別靜置30、60 min，采用雙層平板法計(jì)算噬菌體在各種溫度下的效價(jià)，各個(gè)溫度條件采用3組平行測(cè)試。
1.5.2噬菌體pH穩(wěn)定性測(cè)定
取100μL噬菌體液與900μL不同pH值(2～13)的PBS緩沖液混合，于42℃水浴加熱2 h后，采用雙層平板法測(cè)定噬菌體在不同pH緩沖液的效價(jià)，每個(gè)pH做3組平行。
1.5.3噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定
感染復(fù)數(shù)(multiple of infection，MOI)是指在特定時(shí)間內(nèi)可吸附的噬菌體與宿主菌的比值，是表征裂解性噬菌體侵染能力的一個(gè)重要指標(biāo)。取1 mL對(duì)數(shù)期的空腸彎曲菌菌液(1.0×107CFU/mL)，分別按照0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、100.000的感染復(fù)數(shù)比例加入1 mL稀釋不同濃度的噬菌體，在42℃微需氧搖床，120 r/min條件培養(yǎng)6 h。將混合培養(yǎng)物以12 000 r/min離心2 min。取出100μL的上清液，梯度稀釋?zhuān)缓笥秒p層平板法測(cè)定噬菌體的效價(jià)。做3組平行實(shí)驗(yàn)，噬菌體效價(jià)最高的一組感染復(fù)數(shù)即為最佳感染復(fù)數(shù)。
1.5.4噬菌體一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定
一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定是衡量噬菌體裂解能力的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)，能夠反映噬菌體潛伏期的長(zhǎng)短、裂解量大小等特性。取1 mL對(duì)數(shù)期的空腸彎曲菌菌液，再加入1 mL效價(jià)為1.0×105PFU/mL的噬菌體，按照最佳感染復(fù)數(shù)(MOI=0.01)，將混合液放入42℃微需氧厭氧罐中，120 r/min孵育20 min，使噬菌體充分吸附到宿主菌上。將混合物離心2 min，棄去上清液，用MH肉湯洗滌2次，將沉淀用MH肉湯重懸加入20 mL MH肉湯中，在42℃的微需氧搖床中以120 r/min的速度進(jìn)行培養(yǎng)。定時(shí)取樣，直至300 min。每30 min取樣1次測(cè)定效價(jià)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以噬菌體效價(jià)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
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