犬奇異變形桿菌及其噬菌體分離鑒定、生長曲線及藥敏試驗（三）
2.4噬菌斑及噬菌體電鏡觀察
以分離獲得的奇異變形桿菌PM-XNR為宿主菌，通過雙層瓊脂平板法從污水中分離出1株裂解性噬菌體，命名為vB_PmM_XNR（縮寫為XNR）。在雙層瓊脂平板上可見形狀規則、邊界清晰、透明的噬菌斑（圖1 A）。XNR經負染后電鏡顯示（圖1 B），XNR頭部呈二十面體對稱，直徑約為60±3 nm，具有短尾。
2.5噬菌體的最佳感染復數及一步生長曲線
如表2所示，當MOI=0.01時，噬菌體XNR感染宿主后噬菌體滴度增加了將近104；為XNR的最佳感染復數。
圖3 vB_PmM_XNR噬菌斑和電鏡圖片
表2 vB_PmM_XNR最佳感染復數
當MOI=0.01時噬菌體產出量最高，按0.01的比例繪制一步生長曲線。XNR一步生長曲線如圖4所示。XNR感染宿主菌后15 min內（潛伏期）滴度無明顯的變化，感染后15～55 min內，噬菌體數量急劇增加，可知XNR爆發時間約為40 min，平均裂解量約為80 PFU·cell-（1裂解量=爆發末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度）。
圖4 vB_PmM_XNR一步生長曲線測定
2.6噬菌體熱穩定性、pH穩定性及氯仿敏感性
噬菌體分離自污水中，對環境的適應能力和耐受能力相對較強。溫度敏感性實驗結果（圖5 A）表明，噬菌體vB_PmM_XNR在4℃～42℃之間，活性基本穩定。當溫度升高到60℃時，噬菌體vB_PmM_XNR滴度下降100倍左右；達到70℃時，噬菌體全部失活。
從結果（圖5 B）可以看出噬菌體vB_PmM_XNR經不同的pH處理1 h后，pH值為2.0和12.0時噬菌體失活；而pH值在6.0～8.0范圍內時酸堿度對噬菌體的活性影響不大。上述表明，vB_PmM_XNR具有較好的熱穩定性和耐酸堿性，能夠滿足后續動物體內治療的需要。
圖5噬菌體vB_PmM_XNR的熱穩定性和酸堿穩定性測定
由表3可知，氯仿對噬菌體效價無顯著影響，說明噬菌體vB_PmM_XNR粒子表面不含有脂類物質，對氯仿不敏感。
表3噬菌體vB_PmM_XNR氯仿敏感性
2.7噬菌體對奇異變形桿菌的裂解作用
從圖6中可以看出，XNR對PM-XNR具有較好的裂解作用。XNR作用24 h后，細菌濃度下降3個數量級，由108CFU·mL-1降至105CFU·mL-（1清除效率約為99.9%）；而XNR效價從108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1。PM-XNR濃度隨XNR作用時間延長不斷降低，XNR效價不斷增加，表明噬菌體XNR能夠持續有效抑制和清除細菌。
圖6噬菌體XNR對奇異變形桿菌的裂解作用
3討論與結論
近年來，奇異變形桿菌作為人獸共患的病原體，在人與動物中引起的感染頻繁發生。特別是能夠感染寵物的病原菌，奇異變形桿菌就是其中之一。寵物與人類接觸密切，增加了人類感染性疾病患病幾率，對人類健康造成一定的威脅，同時也受到了廣泛的關注。此外，廣譜抗生素的大量使用及濫用，導致臨床耐藥菌株的產生并且耐藥性不斷增加，這也為臨床治療帶來了較大的挑戰，成為嚴重的醫學問題。從大慶市農大動物醫院患犬尿液中分離到奇異變形桿菌，該菌株具有溶血活性和產脲酶分解尿素，說明該菌株具有致病性，與寵物出現的感染性結石癥狀相吻合。
前期研究表明，多數奇異變形桿菌對氨基糖苷類與β-內酰胺類藥物敏感。林燕青等對2016～2018年奇異變形桿菌耐藥性進行研究，發現奇異變形桿菌對氨芐西林、頭孢唑林、復方新諾明、呋喃妥因的耐藥率均＞50%，并且氨芐西林/舒巴坦的耐藥率從29.8%上升到42.6%；對慶大霉素的耐藥率從35.1%降到27.9%。奇異變形桿菌對頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、阿米卡星的耐藥率均＜6%。楊睿等作用從腹瀉仔豬中分離的15株奇異變形桿菌均有多重耐藥性，其中13株含有3種以上的耐藥基因。結果表明，腹瀉仔豬中分離的奇異變形桿菌含有大量的耐藥基因和多重耐藥性，可以引起仔豬腹瀉癥狀，導致抗生素在臨床治療時不能發揮。試驗對分離的PM-XNR進行藥敏試驗，發現PM-XNR對大多數藥物耐藥或不敏感，僅對四代頭孢吡肟敏感，超出正常寵物的臨床用藥，說明分離自犬的奇異變形桿菌耐藥性極強，這可能與人類或寵物抗菌藥物的使用不當和濫用存在一定聯系。同時，有研究表明將動物源和人源奇異變形桿菌菌株進行了毒力基因、表型方面進行比較，未發現不同來源菌株的毒力特征有明顯的差異。說明犬源奇異變形桿菌對人類健康存在一定威脅。
噬菌體自發現之初便應用于細菌性疾病的治療，并取得了良好的治療效果。由于廣譜抗生素的廣泛應用，使噬菌體的研究逐漸被人們遺忘。1958年余賀利用噬菌體成功治愈了燒傷病人的綠膿桿菌感染，開創了國內噬菌體治療的先河。隨著抗生素的大量及不正確的使用，導致細菌的耐藥性越來越嚴重，每年因細菌耐藥性死亡的人數也在逐漸攀升，據統計到2050年全球每年因細菌耐藥性死亡的人數達100萬人。噬菌體是一類能夠特異性地裂解宿主細菌，不污染環境、無殘留、不易產生耐藥性的病毒，有望成為抗生素的替代藥物。但是，目前臨床上針對奇異變形桿菌并沒有多少裂解性能較好的噬菌體。
研究針對犬源奇異變形桿菌從污水中成功分離到裂解性噬菌體vB_PmM_XNR，電子顯微鏡觀察vB_PmM_XNR具有二十面體頭部結構和可收縮尾部，可判斷為肌尾噬菌體科。噬菌體感染復數（MOI）能夠表示出感染時噬菌體與細菌的數量比值，也是平均每個細胞感染噬菌體的數量，可應用于制備高濃度噬菌體裂解液。研究中，噬菌體XNR的MOI為0.01。按照噬菌體MOI繪制一步生長曲線，可以計算出潛伏期為15 min，爆發期持續40 min，爆發量為80 PFU·cell-1。這與大多數報道的噬菌體的潛伏期和爆發期結果基本相一致，但是爆發量各報道間差異較大。
吸附過程是噬菌體能夠裂解細菌的重要步驟，多數研究表明，吸附過程極易遭受環境（pH、溫度、離子等）因素的影響，在應用過程中，噬菌體還要保證在體內（血液、消化液）等極端環境下生存，因此，要求噬菌體對酸堿度、溫度等有一定的耐受性。vB_PmM_XNR在4℃至42℃之間滴度穩定，滿足噬菌體吸附的最佳溫度范圍；pH 6.0～8.0范圍內活性最好，具有體內應用治療的潛力。該噬菌體經分離純化后，效價穩定、較高，在適宜的條件下24 h可使奇異變形桿菌下降3個數量級，說明XNR具有較好的裂解效率，具有潛在應用價值。噬菌體通過宿主菌及自限性繁殖，是噬菌體具有的基本特征。在裂解奇異變形桿菌的同時，XNR效價從108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1，說明噬菌體在裂解細胞后能夠維持效價穩定，并且有所增加，能夠發揮持續的裂解作用。
試驗從臨床尿石癥病犬尿液中分離獲得奇異變形桿菌。菌株具有溶血活性，能產生脲酶，具有耐藥性，滿足感染性結石癥的特征。以奇異變形桿菌分離株為宿主菌，分離出一株裂解性噬菌體，命名為vB_PmM_XNR。該噬菌體通過對其生物學特性、體外抗菌試驗表明具有治療和控制奇異變形桿菌引起泌尿系統感染的潛力。