巨大芽孢桿菌BM24生長(zhǎng)曲線、耐藥性、益生潛力評(píng)估及藥敏試驗(yàn)（四）
3討論
3.1羊源巨大芽孢桿菌BM24體外益生潛力
宿主和腸道菌群之間存在著特異性相互選擇關(guān)系，動(dòng)物腸道內(nèi)的微生物更易在本體動(dòng)物內(nèi)繁殖和定植。因此，理想的羊用益生菌株應(yīng)該來(lái)自健康羊的胃腸道。本研究從健康新疆細(xì)毛羊新鮮糞便中分離得到1株巨大芽孢桿菌，命名為巨大芽孢桿菌BM24，并對(duì)其進(jìn)行體外益生潛力和小鼠體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)，以為今后養(yǎng)羊業(yè)羊源益生菌的應(yīng)用提供參考。
良好的益生菌特性是:耐酸耐膽鹽、無(wú)溶血活性、抗生素敏感性、抗有害微生物活性。益生菌在宿主腸道定植并發(fā)揮作用，候選菌株需要對(duì)胃的酸性和腸道的膽汁鹽具有一定的耐受性，動(dòng)物胃液的pH通常在3.0左右，羊腸道中的膽鹽濃度在0.03%~0.30%。有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于綿羊乳制品中的植物乳桿菌對(duì)低pH及高濃度膽鹽有較好的耐受性;田亮金等研究表明，在人工胃液和腸液的作用下，巨大芽孢桿菌A20、A27、B47和B89的存活率均可高于60%。本試驗(yàn)分離出的羊源巨大芽孢桿菌BM24在pH為3.0時(shí)存活率為73.63%，pH為1.0時(shí)仍有28.28%的存活率，表明其具有良好的耐酸能力;同時(shí)，該菌株能夠在0.1%~0.3%膽鹽下存活，有較好的膽鹽耐受性，與不同種屬的芽孢桿菌耐膽鹽特性相似，表明羊源巨大芽孢桿菌BM24能夠耐受胃腸道環(huán)境。
益生菌具有在腸道中轉(zhuǎn)移抗生素抗性基因至病原菌中的潛在能力，因此候選益生菌在應(yīng)用前必須進(jìn)行抗生素耐藥性評(píng)估。本研究使用15種常見(jiàn)抗生素對(duì)羊源巨大芽孢桿菌BM24進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)其中12種抗生素表現(xiàn)出高度敏感，表明該菌株的耐藥性低，安全性高。有研究發(fā)現(xiàn)，羊源地衣芽孢桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素、慶大霉素和四環(huán)素等抗生素敏感;徐淑琴等發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于藏羊瘤胃液中的1株沙福芽孢桿菌對(duì)青霉素類、氨基糖苷類及多肽類等抗生素表現(xiàn)出敏感性;陳永亮等從散養(yǎng)草雞內(nèi)臟中分離出的1株巨大芽孢桿菌201706J對(duì)諾氧沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素等常用抗生素均敏感，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。候選益生菌是否有溶血性是評(píng)估菌株益生潛力的重要條件之一，本研究分離得到的羊源巨大芽孢桿菌BM24不具有溶血活性，與周海歐等的研究結(jié)果相一致。
已有研究表明，芽孢桿菌可通過(guò)分泌細(xì)菌素、磷脂類、抗菌肽等抗菌物質(zhì)，破壞病原菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，抑制病原菌的生長(zhǎng)。Rajput等研究發(fā)現(xiàn)，從羊奶中分離到的腸球菌具有抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的作用。來(lái)源于育肥綿羊空腸的海氏腸球菌對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌具有一定的抑制效果。巨大芽孢桿菌L2發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)E4-3可抑制胡蘿卜軟腐歐文氏菌EC-1生長(zhǎng)。菌株L2粗提物L(fēng)E4-5對(duì)2種食品植物病原菌株青枯雷爾氏菌RS-2和根癌農(nóng)桿菌T-37的生長(zhǎng)均有較好的抑制效果。有研究發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌JX-1對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制效果，巨大芽孢桿菌N17-12對(duì)副傷寒沙門氏菌和大腸桿菌有明顯的抑制作用。巨大芽孢桿菌MIT411對(duì)大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及空腸彎曲桿菌有良好的抗菌活性。在本研究中，羊源巨大芽孢桿菌BM24對(duì)常見(jiàn)腹瀉致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出良好的抑制能力。
益生菌進(jìn)入腸道后，通常需要快速定植并迅速生長(zhǎng)，從而在微生物競(jìng)爭(zhēng)中獲得優(yōu)勢(shì)，成為優(yōu)勢(shì)菌群。趙龍妹等研究發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌XT2在2~10 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體增殖迅速，10~20 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。本研究分離得到的羊源巨大芽孢桿菌BM24在2~6 h即可進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，表明其具有良好的生長(zhǎng)特性。
3.2羊源巨大芽孢桿菌BM24體內(nèi)安全性
潛在益生菌株在投入生產(chǎn)前需要進(jìn)行體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)，急性口服毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)益生菌是否安全的最基本安全性評(píng)估試驗(yàn)。鐘羅華等研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)口服巨大芽孢桿菌液1周，整個(gè)試驗(yàn)期間小鼠無(wú)死亡及腹瀉，且巨大芽孢桿菌組小鼠體重有明顯的增加。在其他潛在益生菌株體內(nèi)安全性研究中，白海等以小鼠為動(dòng)物模型評(píng)估了枯草芽孢桿菌的安全性。Abid等從牛奶中分離發(fā)酵乳桿菌而后通過(guò)21 d連續(xù)灌胃小鼠證明其是安全無(wú)毒的。張楠馳等采用高濃度菌懸液灌胃小鼠的方法評(píng)價(jià)羊源解淀粉芽孢桿菌fsznc-06的安全性，結(jié)果表明該菌對(duì)小鼠未造成負(fù)面影響。向微微等通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃及腹腔注射試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羊源彎曲乳桿菌Y15具有良好的安全性。Hou等發(fā)現(xiàn)，綿羊源地衣芽孢桿菌B63對(duì)昆明小鼠及SD大鼠無(wú)毒副作用。本試驗(yàn)中，腹腔注射羊源巨大芽孢桿菌BM24后的7 d觀察期間，小鼠的生理狀態(tài)均正常，無(wú)發(fā)病和死亡，解剖后小鼠體內(nèi)臟器眼觀均無(wú)異常癥狀，表明羊源巨大芽孢桿菌BM24無(wú)急性致病性;經(jīng)過(guò)連續(xù)14 d的灌胃羊源巨大芽孢桿菌BM24，發(fā)現(xiàn)所有小鼠的飲水、采食、糞便及活動(dòng)均正常，無(wú)小鼠死亡;灌胃試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，小鼠體重、血細(xì)胞指標(biāo)均無(wú)顯著差異，肝臟、脾臟、腎臟均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化，且2組小鼠臟器指數(shù)無(wú)顯著差異。綜上所述，本試驗(yàn)分離得到的菌株羊源巨大芽孢桿菌BM24對(duì)小鼠無(wú)毒副作用，作為益生菌來(lái)使用是安全的。
4結(jié)論
本研究從健康細(xì)毛羊糞便中分離的巨大芽孢桿菌BM24不僅在體外表現(xiàn)出對(duì)酸和膽鹽良好的耐受性，對(duì)多種常見(jiàn)抗生素敏感，對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，不具有溶血活性，生長(zhǎng)速度快，而且在小鼠體內(nèi)通過(guò)灌胃和腹腔注射試驗(yàn)證明了其具有良好的安全性，可作為羊源益生菌菌株今后在養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)中使用。
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