檢測細菌菌落數，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)濃度多少合適
細菌菌落計數是判別食品(或飼料)污染程度的指標，觀察細菌在食品(或飼料)中的繁殖動態(tài)，以便對被檢測樣品進行衛(wèi)生學評價。在測定食品(或飼料)菌落總數實際工作中，常因檢測樣品中含有的微小顆粒沉渣與生長于瓊脂內部的菌落難以區(qū)分、部分菌落細小或菌落顏色與瓊脂較相近，給菌落計數帶來一定的困難，進而造成實驗誤差。
2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)能夠被細菌還原成紅色物質，添加到培養(yǎng)基中可使菌落呈紅色，觀測和計數時可使菌落與樣品細小顆粒區(qū)分開，提高了檢測效率和準確度。但過量的TTC也會抑制細菌的生長，為此，培養(yǎng)基中適宜的TTC濃度是準確檢測細菌菌落數的重要前提。本試驗探討培養(yǎng)基中不同TTC濃度與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌生長數量的關系，研究TTC的安全用量。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌(中國藥品生物制品中心)。
1.1.2試劑蛋白胨、牛肉膏(美國BD公司)；酵母浸出粉(英國OXOID公司)；氯化鈉、葡萄糖(分析純，北京化工廠)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(分析純，Sigma公司)。
1.2方法
1.2.11%TTC的配制稱取1g TTC，加入100mL蒸餾水，完全溶解后，用0.22μm濾膜除菌，于4℃冰箱中避光保存。
1.2.2菌液制備將-20℃保存的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的液體培養(yǎng)物分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置36±1℃培養(yǎng)24h，挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌典型菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，36±1℃培養(yǎng)24h。比濁法確定細菌濃度約為n×108CFU/mL，以上菌液依次作10倍稀釋，制備成濃度約為n×101CFU/mL的菌液。
1.2.3不同TTC濃度計數瓊脂的配制計數瓊脂按培養(yǎng)基配方稱取后，調pH，分裝后滅菌，待冷至56℃，分別加入無菌1%TTC溶液，使終濃度分別為0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，搖勻混勻，置于46℃水浴鍋中備用。
1.2.4細菌的倒入參照國家標準GB4789.2-2010操作，用1mL滅菌吸管分別取上述細菌稀釋液于2組滅菌平板內各1mL，將46℃水浴中含不同濃度TTC的計數瓊脂(包括不含TTC)注入平板內約25mL，并轉動平板使混合均勻，同時分別將平板計數瓊脂25mL注入滅菌平板及加有1mL滅菌生理鹽水平板內作空白和試劑對照，待瓊脂凝固后翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養(yǎng)48h，觀察結果。
2結果
2.1大腸埃希菌在不同TTC濃度的計數瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況
大腸埃希菌在不同TTC濃度試驗組中，TTC終濃度為0.002%時，菌落呈紅色，菌落大小與對照組相當；TTC終濃度≤0.01%時，菌落數量和對照組基本相當；TTC終濃度≥0.02%時，菌落呈黑色、點狀，菌落數量也明顯減少(表1)。
表1不同TTC濃度計數瓊脂培養(yǎng)基中大腸埃希菌生長檢測結果
2.2金黃色葡萄球菌在不同TTC濃度計數瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況
金黃色葡萄球菌在不同TTC濃度試驗組中，菌落顏色變化和大腸埃希菌組相同，只是在TTC終濃度≤0.004%時，菌落數量和對照組基本相當；TTC終濃度≥0.006%時，菌落數量明顯減少；TTC終濃度≥0.02%時，幾乎無菌落出現(表2)。
表2不同TTC濃度計數瓊脂培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長檢測結果
2.3鼠傷寒沙門氏菌在不同TTC濃度計數瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況
鼠傷寒沙門氏菌在不同TTC濃度試驗組中，菌落顏色變化和大腸埃希菌組、金黃色葡萄球菌組變化基本相同。菌落數量在TTC終濃度≤0.01%時，和對照組基本相當；TTC終濃度≥0.02%時，菌落數量和對照組相比逐漸減少(表3)。
表3不同TTC濃度計數瓊脂培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌生長檢測結果
3結論
3.1在食品(或飼料)的加工、貯藏、運輸過程中被污染的細菌種類很多，包括致病菌、條件性致病菌和非致病性細菌，如埃希菌屬、沙門氏菌屬、變形桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬等。歸納起來主要為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。本次試驗選取大腸埃希菌、鼠傷寒沙門氏菌為革蘭氏陰性菌代表，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌代表。
3.2食品(或飼料)進行檢測時，一些殘渣微粒不可避免地被吸入，影響了細菌菌落總數的計數。添加一定濃度的TTC于平板計數瓊脂培養(yǎng)基中，細菌在生長過程中能與其結合形成紅色，殘渣則保持原有的顏色，更有利于計數。TTC在使用時，應配制成溶液，4℃避光保存；TTC不耐高溫，易吸潮，所以不能直接加入到培養(yǎng)基中滅菌；TTC溶液向培養(yǎng)基中添加時，培養(yǎng)基的溫度也不宜過高，否則會使培養(yǎng)基變成紅褐色，導致TTC失效。TTC溶液加入56℃水浴保溫的培養(yǎng)基中，使TTC與培養(yǎng)基混合均勻并冷卻到46℃時，再與待檢樣品混合，鋪板，以免細菌被燙死。
3.3使用適宜終濃度的TTC測定菌落總數時，由于菌落呈紅色，與培養(yǎng)基顏色差別明顯，與不含TTC的培養(yǎng)基計數相比計數方便、耗時短，提高了工作效率。賈杰選0.2%TTC溶液于培養(yǎng)基中，采集飲用水、酒、醬油、消毒牛奶、棒冰共105份樣品，利用TTC-涂抹法進行試驗，結果TTC濃度為0.2%組結果優(yōu)于國家標準方法，但涂抹法的缺點是加入樣品量少，所造成的誤差較大；王曉文等用浸泡濾紙法進行抑菌試驗，但紙片中TTC的量難以控制；楊慶文等通過加入不同濃度的TTC得出添加0.2%TTC時為宜的結論，但TTC濃度的使用范圍較窄。本實驗選用平板灌注法對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌進行檢測，結果顯示，TTC終濃度在0.0008%～0.004%之間的平板計數瓊脂培養(yǎng)基最佳，在該濃度下能很好地使菌落顯色，同時又不會抑制細菌生長。
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