檢測細(xì)菌菌落數(shù)，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)濃度多少合適
細(xì)菌菌落計數(shù)是判別食品(或飼料)污染程度的指標(biāo)，觀察細(xì)菌在食品(或飼料)中的繁殖動態(tài)，以便對被檢測樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價。在測定食品(或飼料)菌落總數(shù)實際工作中，常因檢測樣品中含有的微小顆粒沉渣與生長于瓊脂內(nèi)部的菌落難以區(qū)分、部分菌落細(xì)小或菌落顏色與瓊脂較相近，給菌落計數(shù)帶來一定的困難，進(jìn)而造成實驗誤差。
2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)能夠被細(xì)菌還原成紅色物質(zhì)，添加到培養(yǎng)基中可使菌落呈紅色，觀測和計數(shù)時可使菌落與樣品細(xì)小顆粒區(qū)分開，提高了檢測效率和準(zhǔn)確度。但過量的TTC也會抑制細(xì)菌的生長，為此，培養(yǎng)基中適宜的TTC濃度是準(zhǔn)確檢測細(xì)菌菌落數(shù)的重要前提。本試驗探討培養(yǎng)基中不同TTC濃度與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌生長數(shù)量的關(guān)系，研究TTC的安全用量。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌(中國藥品生物制品中心)。
1.1.2試劑蛋白胨、牛肉膏(美國BD公司)；酵母浸出粉(英國OXOID公司)；氯化鈉、葡萄糖(分析純，北京化工廠)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(分析純，Sigma公司)。
1.2方法
1.2.11%TTC的配制稱取1g TTC，加入100mL蒸餾水，完全溶解后，用0.22μm濾膜除菌，于4℃冰箱中避光保存。
1.2.2菌液制備將-20℃保存的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的液體培養(yǎng)物分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置36±1℃培養(yǎng)24h，挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌典型菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，36±1℃培養(yǎng)24h。比濁法確定細(xì)菌濃度約為n×108CFU/mL，以上菌液依次作10倍稀釋，制備成濃度約為n×101CFU/mL的菌液。
1.2.3不同TTC濃度計數(shù)瓊脂的配制計數(shù)瓊脂按培養(yǎng)基配方稱取后，調(diào)pH，分裝后滅菌，待冷至56℃，分別加入無菌1%TTC溶液，使終濃度分別為0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，搖勻混勻，置于46℃水浴鍋中備用。
1.2.4細(xì)菌的倒入?yún)⒄諊覙?biāo)準(zhǔn)GB4789.2-2010操作，用1mL滅菌吸管分別取上述細(xì)菌稀釋液于2組滅菌平板內(nèi)各1mL，將46℃水浴中含不同濃度TTC的計數(shù)瓊脂(包括不含TTC)注入平板內(nèi)約25mL，并轉(zhuǎn)動平板使混合均勻，同時分別將平板計數(shù)瓊脂25mL注入滅菌平板及加有1mL滅菌生理鹽水平板內(nèi)作空白和試劑對照，待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。
2結(jié)果
2.1大腸埃希菌在不同TTC濃度的計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況
大腸埃希菌在不同TTC濃度試驗組中，TTC終濃度為0.002%時，菌落呈紅色，菌落大小與對照組相當(dāng)；TTC終濃度≤0.01%時，菌落數(shù)量和對照組基本相當(dāng)；TTC終濃度≥0.02%時，菌落呈黑色、點(diǎn)狀，菌落數(shù)量也明顯減少(表1)。
表1不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中大腸埃希菌生長檢測結(jié)果
2.2金黃色葡萄球菌在不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況
金黃色葡萄球菌在不同TTC濃度試驗組中，菌落顏色變化和大腸埃希菌組相同，只是在TTC終濃度≤0.004%時，菌落數(shù)量和對照組基本相當(dāng)；TTC終濃度≥0.006%時，菌落數(shù)量明顯減少；TTC終濃度≥0.02%時，幾乎無菌落出現(xiàn)(表2)。
表2不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長檢測結(jié)果
2.3鼠傷寒沙門氏菌在不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中的生長情況
鼠傷寒沙門氏菌在不同TTC濃度試驗組中，菌落顏色變化和大腸埃希菌組、金黃色葡萄球菌組變化基本相同。菌落數(shù)量在TTC終濃度≤0.01%時，和對照組基本相當(dāng)；TTC終濃度≥0.02%時，菌落數(shù)量和對照組相比逐漸減少(表3)。
表3不同TTC濃度計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌生長檢測結(jié)果
3結(jié)論
3.1在食品(或飼料)的加工、貯藏、運(yùn)輸過程中被污染的細(xì)菌種類很多，包括致病菌、條件性致病菌和非致病性細(xì)菌，如埃希菌屬、沙門氏菌屬、變形桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬等。歸納起來主要為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。本次試驗選取大腸埃希菌、鼠傷寒沙門氏菌為革蘭氏陰性菌代表，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌代表。
3.2食品(或飼料)進(jìn)行檢測時，一些殘渣微粒不可避免地被吸入，影響了細(xì)菌菌落總數(shù)的計數(shù)。添加一定濃度的TTC于平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中，細(xì)菌在生長過程中能與其結(jié)合形成紅色，殘渣則保持原有的顏色，更有利于計數(shù)。TTC在使用時，應(yīng)配制成溶液，4℃避光保存；TTC不耐高溫，易吸潮，所以不能直接加入到培養(yǎng)基中滅菌；TTC溶液向培養(yǎng)基中添加時，培養(yǎng)基的溫度也不宜過高，否則會使培養(yǎng)基變成紅褐色，導(dǎo)致TTC失效。TTC溶液加入56℃水浴保溫的培養(yǎng)基中，使TTC與培養(yǎng)基混合均勻并冷卻到46℃時，再與待檢樣品混合，鋪板，以免細(xì)菌被燙死。
3.3使用適宜終濃度的TTC測定菌落總數(shù)時，由于菌落呈紅色，與培養(yǎng)基顏色差別明顯，與不含TTC的培養(yǎng)基計數(shù)相比計數(shù)方便、耗時短，提高了工作效率。賈杰選0.2%TTC溶液于培養(yǎng)基中，采集飲用水、酒、醬油、消毒牛奶、棒冰共105份樣品，利用TTC-涂抹法進(jìn)行試驗，結(jié)果TTC濃度為0.2%組結(jié)果優(yōu)于國家標(biāo)準(zhǔn)方法，但涂抹法的缺點(diǎn)是加入樣品量少，所造成的誤差較大；王曉文等用浸泡濾紙法進(jìn)行抑菌試驗，但紙片中TTC的量難以控制；楊慶文等通過加入不同濃度的TTC得出添加0.2%TTC時為宜的結(jié)論，但TTC濃度的使用范圍較窄。本實驗選用平板灌注法對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，TTC終濃度在0.0008%～0.004%之間的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基最佳，在該濃度下能很好地使菌落顯色，同時又不會抑制細(xì)菌生長。
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