生長曲線測定法和菌落計數(shù)法確定YchJ對鼠傷寒沙門菌抗逆能力的影響——方法
2方法
2.2ychJ敲除菌株構(gòu)建及驗證
2.2.1ychJ敲除菌株的構(gòu)建
使用表1中包含同源臂序列的引物JDychJF和JDychJR進(jìn)行PCR擴(kuò)增打靶區(qū)域，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，確認(rèn)gRNA打靶位點序列的正確性。將CRISPRB質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入ATCC14028s感受態(tài)細(xì)胞，將線性打靶DNA片段電轉(zhuǎn)化入ATCC14028sCRISPRB感受態(tài)細(xì)胞，選擇測序正確的克隆，將CRISPRB質(zhì)粒消去，獲得敲除陽性克隆菌株ATCC14028sΔychJ.
2.2.2ychJ敲除菌株的驗證將過夜培養(yǎng)的WT及ΔychJ按1∶100轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min條件下培養(yǎng)至A600值約為0.5.以菌液為模板，使用表1中ychJF和ychJR為引物對兩株菌進(jìn)行基因擴(kuò)增驗證。其余菌液經(jīng)5000r/min離心2min后棄上清，收集菌體。用RNA提取試劑盒提取細(xì)菌總RNA,然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.使用實時熒光定量PCR試劑盒加入ychJ基因特異引物ychJ5和ychJ3T進(jìn)行實時定量PCR實驗。內(nèi)參選用16sRNA.引物序列如表1.
2.3生物膜形成能力檢測
2.3.1剛果紅染色法
配制剛果紅培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10mg/mL,酵母粉5mg/mL,瓊脂粉7.5mg/mL,剛果紅40μg/mL,121℃高壓滅菌30min,獲得剛果紅平板。取2μL過夜培養(yǎng)的菌液輕輕點在剛果紅平板上，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h,觀察細(xì)菌生物膜表型。2.3.2結(jié)晶紫半定量法將過夜培養(yǎng)的WT及ΔychJ菌株按1∶100轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min條件下培養(yǎng)至A600值約為0.5,隨后再次按1∶100稀釋于LB液體培養(yǎng)基中。將稀釋后的菌液轉(zhuǎn)接至96孔板中，30℃靜置培養(yǎng)72h.測量每孔A600值后，棄去菌液。測量每孔A600值后，用PBS沖洗，加入甲醇固定20min,0.1%的結(jié)晶紫染色液，靜置染色15min,最后加入乙酸溶液，溶解結(jié)晶紫染料。在570nm下測定每孔吸光度，A570/A600與生物膜生長量成正比。
2.4抗生素耐受性檢測
2.4.1生長曲線測定法
將過夜培養(yǎng)的WT及ΔychJ菌株按1∶100轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min條件下培養(yǎng)至A600值約為0.5,隨后再次按1∶100稀釋于LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為0.5μg/mL氨芐青霉素或0.1μg/mL諾氟沙星。在96孔生長曲線測定板中加入300μL/孔的菌液，隨后將孔板放入生長曲線儀中進(jìn)行A600值的測定。儀器參數(shù)設(shè)定：溫度為37℃，測定波長為600nm,振蕩頻率為10s/min,間隔檢測時間為5min,連續(xù)記錄24h.
2.4.2菌落計數(shù)法
分別取生長曲線測定實驗中培養(yǎng)5h（對數(shù)期）及12h（平臺期）的菌液，用PBS進(jìn)行10倍稀釋，稀釋后的菌液涂布于LB瓊脂平板上，37℃靜置培養(yǎng)過夜，再用微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)計數(shù)平板中細(xì)菌數(shù)目。
2.5移動性檢測
將過夜培養(yǎng)的WT及ΔychJ菌株按1∶100轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min條件下培養(yǎng)至A600值約為0.5.取1mL菌液3000r/min低速離心5min,棄上清后用20μLPBS重懸，吸取1μL重懸液滴在含0.25%瓊脂的半固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)24h,測量菌圈直徑，以確定運動能力的差異。
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