雞印第安納株沙門菌生長、致病性及藥物敏感性研究（一）
沙門菌屬(Salmonella)隸屬腸桿菌科(Enter?obacteriaceae)，擁有2 600多個血清型，是世界范圍內造成人類和動物感染最頻繁的人畜共患病原菌之一。禽類是沙門菌的天然宿主，其中危害雞健康的主要血清型包括雞白痢、雞傷寒、腸炎、鼠傷寒、印第安納等，沙門菌可同時通過水平和垂直方式在雞群中進行傳播。沙門菌不僅可以造成雞的感染發病，給養雞產業造成巨大的經濟損失，還可以通過肉蛋產品傳染給人類，持續地威脅食品和公共衛生安全。
目前，沙門菌在國內雞群中的流行形勢依然復雜嚴峻。Song等在國內9個省17個家禽養殖場調查發現，主要流行雞白痢、腸炎和阿哥納沙門菌，其中也分離到印第安納沙門菌。對江蘇某企業肉雞產業鏈調查發現，印第安納沙門菌和腸炎沙門菌為優勢血清型，并且攜帶多種毒力島基因。
針對廣東、廣西、福建和上海地區零售雞肉源沙門菌血清型調查研究表明，腸炎、鼠傷寒、印第安納、湯卜遜沙門菌較常見。本研究團隊對安徽地區雞源沙門菌流行特征的研究顯示，安徽地區以腸炎、鼠傷寒和雞白痢沙門菌為優勢血清型，其中也分離到8株印第安納沙門菌。
以上研究表明印第安納血清型沙門菌是國內雞群及其雞肉加工和銷售產業鏈中較常見的流行血清型。細菌耐藥性的產生給家禽細菌性疫病的防治帶來不利影響。研究發現，從雞群中分離的沙門菌多重耐藥性比例達到70%左右，其中對青霉素類、四環素類、氯霉素和磺胺類抗生素表現出較強的耐藥性，而對氨基糖苷類和喹諾酮類的耐藥性較弱。
安徽地區雞源沙門菌顯示出對青霉素類、四環素類和磺胺類抗生素的高耐藥率，其中43.52%的菌株為多重耐藥菌株并且具有復雜的抗生素耐藥譜。
本研究從安徽省肥東縣一養雞場發病雞病變組織中分離到1株印第安納株沙門菌，對該分離株進行了生長、致病性、耐藥性等相關特性的研究，并通過全基因組序列分析挖掘該菌株的毒力和耐藥基因攜帶情況，以期為雞場沙門菌病臨床治療提供指導，也為深入研究沙門菌致病和耐藥的分子機制奠定基礎。
1材料與方法
1.1病料
病料來自安徽省肥東縣一土雞養殖場，該養殖場為林地散養模式，發病雞群為72日齡。將2只發病雞送至安徽省農科院獸醫臨床指導中心進行剖檢，發現其中1只病雞肝臟呈現典型的古銅色病變，疑似存在沙門菌感染。
1.2主要材料
SPF雞胚購自濟南鑫盛達生物工程有限公司，由本研究室進行孵化和雛雞飼養。緩沖蛋白胨水(PBW)、氯化鎂孔雀綠增菌液(MM)和木糖賴氨酸培養基(XLT4)均購自青島海博生物技術有限責任公司。2×PCR Premix、DL2000 DNA Marker、細菌基因組提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢曲松、恩諾沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、新霉素、大觀霉素、慶大霉素、阿米卡星、多西環素、四環素、氯霉素、氟苯尼考、復方新諾明、甲氧芐啶、阿奇霉素、呋喃唑酮、亞胺培南、氨曲南和多黏菌素B共23種Kirby-Bauer藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。
1.3細菌的分離鑒定
無菌采集2只病雞肝臟樣本作為細菌分離材料，接種到PBW進行預增菌培養，37℃培養12 h，而后轉接到MM選擇性增菌液中42℃培養16 h。在無菌條件下劃線接種到XLT4培養基，37℃培養16 h。挑選中心呈黑色的疑似菌落接種到LB培養基中，37℃培養12 h。取菌液2 mL，12 000 r/min離心5 min，收集菌體，采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌全基因組。利用16S rRNA基因通用引物進行PCR鑒定菌屬，引物序列為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC?·16AG-3′，1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系25μL:PCR Premix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，滅菌雙蒸水補至25μL。PCR反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個循環;72℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。