忍冬提取液對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線、細(xì)胞形態(tài)和生物膜形成能力的影響（二）
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1忍冬不同部位總酚、總黃酮和綠原酸含量測(cè)定
1.2.1.1忍冬不同部位總酚、總黃酮和綠原酸的提取
將金銀花、忍冬葉和忍冬藤60℃熱風(fēng)干燥至恒重，粉碎后過50目篩，備用。稱取1 g樣品，加入15 mL 60%乙醇，60℃、200 W超聲水浴提取30 min。在4℃下10000 r/min離心10 min，收集上清液，過0.22μm濾膜，于4℃冰箱保存。
1.2.1.2總酚含量的測(cè)定
采用Folin-Ciocalteu法，將1 mL樣品與5 mL Folin-Ciocalteu混合，反應(yīng)5 min，加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，避光反應(yīng)60 min，在765 nm下測(cè)定。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程（y=0.0067x?0.0781，R2=0.9979）計(jì)算總酚含量，結(jié)果以每g樣品的沒食子酸當(dāng)量mg表示（mg GAE/g）。
1.2.1.3總黃酮含量的測(cè)定
采用AlCl3比色法，將1 mL樣品與0.5 mL 5%NaNO2溶液混合，反應(yīng)5 min，加入1 mL 5%AlCl3溶液反應(yīng)5 min，加入2 mL 8%NaOH溶液反應(yīng)10 min，在510 nm下測(cè)定。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程（y=0.0026x?0.0399，R2=0.9991）計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果以每g樣品的蘆丁當(dāng)量mg表示（mg RE/g）。
1.2.1.4綠原酸含量的測(cè)定
采用高效液相色譜法，色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；色譜條件：溫度30℃；檢測(cè)波長320 nm；進(jìn)樣體積20μL；體積流量0.6 mL/min；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫條件為0~10 min，5%~30%A；10~25 min，30%~50%A；25~35 min，50%~70%A；35~40 min，70%~5%A。以綠原酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程（y=30726x?688902，R2=0.9996）計(jì)算綠原酸含量，結(jié)果以每g樣品的綠原酸當(dāng)量mg表示（mg CGA/g）。
1.2.2忍冬不同部位提取液抑菌譜的測(cè)定
1.2.2.1菌株的活化與培養(yǎng)
菌株培養(yǎng)基的選擇與制備：L.acidophilus、L.plantarum、L.rhamnosus選用MRS肉湯培養(yǎng)基；A.acidoterrestris選用AAM培養(yǎng)基；S.agalactiae、L.monocytogenes選用BHI培養(yǎng)基；S.aureus、B.subtilis選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；E.coli、Salmonella選用LB培養(yǎng)基；C.jejuni選用布氏肉湯培養(yǎng)基；K.marxianus選用YPD培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基均在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%的瓊脂粉，在121℃下高壓滅菌15 min。菌株的活化：將凍藏菌株分別接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，然后在37℃、250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h（A.acidoterrestris培養(yǎng)溫度為45℃），然后將菌液稀釋涂布，靜置培養(yǎng)18 h。菌株的培養(yǎng)：從各菌株平板上挑取一個(gè)單菌落，接種至10 mL培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，然后以1.0%體積比轉(zhuǎn)接至50 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，最后稀釋成1×106 CFU/mL的菌懸液，備用。
1.2.2.2忍冬不同部位提取液的制備
稱取10 g樣品，加入100 mL 60%乙醇，60℃、200 W超聲水浴提取30 min，10000 r/min離心10 min，收集上清液，向沉淀中再次加入100 mL乙醇，超聲水浴30 min后離心，重復(fù)3次。合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL，即得濃度為1 g/mL的提取液。
1.2.2.3抑菌譜的測(cè)定
采用牛津杯法，將100μL菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基平板上，用牛津杯在平板上打孔，然后加入提取液100μL，于恒溫箱中培養(yǎng)至肉眼觀察到透明圈為止，無菌水作空白對(duì)照，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。
1.2.3忍冬不同部位提取液MIC和MBC的測(cè)定
采用二倍稀釋法，用液體培養(yǎng)基對(duì)提取液進(jìn)行二倍稀釋，得到濃度為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL的忍冬提取液。分別將100μL各濃度忍冬提取液加入100μL菌懸液，混勻后培養(yǎng)24 h，以澄清無渾濁的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。培養(yǎng)基作對(duì)照，用于驗(yàn)證細(xì)菌正常生長，記為CK1；加入提取液而不加菌液，用于驗(yàn)證提取液是否受污染，記為CK2。在MIC的基礎(chǔ)上，取培養(yǎng)液100μL均勻涂布于固體平板上培養(yǎng)48 h，以無活菌存在的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）。
1.2.4忍冬不同部位提取液對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線的影響
參考Cui等的方法，向菌懸液中加入金銀花和忍冬葉提取液，至終濃度為1 MIC、2 MIC和MBC，不加提取液的作為對(duì)照組，45℃、250 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定OD600 nm值，繪制生長曲線。
1.2.5忍冬不同部位提取液對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響
采用掃描電子顯微鏡（SEM）法，向菌懸液加入金銀花和忍冬葉提取液，至終濃度為1 MIC、2 MIC和4 MIC，不加提取液的作為對(duì)照組，45℃、250 r/min培養(yǎng)8 h。4000 r/min，離心10 min，棄上清液，用無菌PBS清洗2次，用1 mL 2.5%戊二醇固定細(xì)胞形態(tài)。用PBS（0.1 mol/L，pH7.0）洗滌3次，然后使用一系列梯度濃度的乙醇（30%、50%、80%、90%和95%）進(jìn)行脫水，每種濃度進(jìn)行2次，每次15 min。脫水后在?20℃下預(yù)凍2 h，然后真空冷凍干燥。干燥完全后濺射鍍金，在掃描電鏡下觀察。
1.2.6忍冬不同部位提取液對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜形成能力的影響
采用結(jié)晶紫染色法，將200μL菌懸液置于96孔板中，加入金銀花和忍冬葉提取液，至終濃度為1 MIC、2 MIC、4 MIC，不加提取液的作為對(duì)照組，45℃靜置培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)液，用200μL無菌PBS（0.03 mol/L，pH7.2）洗滌3次，加入100μL甲醇，固定15 min后吸出。加入100μL 1%結(jié)晶紫溶液，染色15 min，將結(jié)晶紫溶液吸出，用PBS將顏色沖洗干凈。加入100μL 33%CH3COOH溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD590 nm值。
1.3數(shù)據(jù)處理
每組均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 9.0進(jìn)行繪圖。
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