忍冬提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌生長曲線、細胞形態和生物膜形成能力的影響（四）
2.3忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌的MIC和MBC
金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris均有較強的抑制作用，但抑制效果隨濃度的降低而減弱（表2）。當提取液濃度為3.91 mg/mL時，仍表現出抑制作用，培養液仍澄清透明。因此，金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的MIC均為3.91 mg/mL。在MIC值的基礎上，測定了金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的MBC值。結果表明，金銀花與忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的殺菌效果相同，當提取液濃度為31.25 mg/mL時，仍無活菌存在，金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的MBC值均為31.25 mg/mL。
表2忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌的MIC和MBC
2.4忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌生長曲線的影響
微生物生長過程中，菌液濃度往往與OD600 nm下的吸光度呈正相關，因此可通過測定A.acidoterrestris相應培養時間與A.acidoterrestris菌液吸光度之間的變化來判定A.acidoterrestris的生長狀況。測定不同濃度的金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris生長曲線的影響以進一步探究其抑菌作用（圖2）。對照組的A.acidoterrestris正常生長，遲緩期為2 h，隨后進入對數期，在12 h時A.acidoterrestris菌液密度最高，其吸光度達到（1.301±0.032），隨后進入生長穩定期。當花和葉抑菌濃度為1 MIC時，菌體生長被抑制，直至24 h時，菌體開始生長，吸光度分別為0.159±0.032和0.144±0.021，兩者抑菌效果無顯著性差異（P>0.05）。當濃度達到2 MIC時，A.acidoterrestris的生長明顯被抑制，24 h內菌液的吸光度均無明顯變化。隨著提取液濃度繼續增大到MBC時，A.acidoterrestris無生長跡象。結果表明，金銀花和忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的抑菌效果相同，并隨著濃度的增大，抑菌效果更明顯。
圖2忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌生長曲線的影響
2.5忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌細胞形態的影響
對照組A.acidoterrestris呈現桿狀，菌體形態完好，表面光滑，未觀察到細胞破損或內容物溢出等現象（圖3）。隨著金銀花和忍冬葉提取液濃度的增大，A.acidoterrestris的菌體形態發生不同程度的變化。當濃度為1 MIC時，A.acidoterrestris的菌體表面變得粗糙，出現褶皺和凹陷現象。濃度為2 MIC時，A.acidoterrestris的菌體損傷更明顯，呈凹凸不平的無規則形態，細胞界限變得模糊，表面出現孔洞，細胞基質出現外泄現象。在4 MIC濃度下，A.acidoterrestris的菌體被嚴重破壞，內容物溶出，細胞膜幾乎完全破裂，難以維持正常形態。Cai等使用綠原酸和肉桂酸處理A.acidoterrestris，研究發現綠原酸和肉桂酸對A.acidoterrestris的抑菌作用機制歸因于對菌體細胞膜的破壞，導致細胞膜發生破裂，進而導致蛋白質和核酸的泄漏。Li等研究發現，對香豆酸對A.acidoterrestris的作用機制是由于對香豆酸的作用導致細胞內ATP減少，對香豆酸可以與DNA相互作用，干擾正常的細胞功能，A.acidoterrestris細胞膜完整性受損，細胞形態出現畸變。綜上所述，忍冬提取液對A.acidoterrestris的抑制作用可能是忍冬中豐富的綠原酸、多酚和黃酮等活性成分嚴重破壞了A.acidoterrestris的細胞膜結構，致使菌體形態發生變化，細胞基質外泄，難以正常生長。
圖3忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌細胞形態的影響
注：（a）：不同濃度金銀花提取液對脂環酸芽孢桿菌細胞形態的影響；（b）：不同濃度忍冬葉提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌細胞形態的影響；A：Control，B：1 MIC，C：2 MIC，D：4 MIC。
2.6忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌生物膜形成能力的影響
如圖4（a）所示，經忍冬不同部位提取液處理后，A.acidoterrestris的生物膜量顯著低于對照組（P<0.05），且隨著金銀花和忍冬葉提取液濃度的增大，染色液OD590 nm值整體呈現逐漸降低的趨勢，與之對應的96孔板顏色逐漸變淺（圖4（b））。當提取液濃度為4 MIC時，OD590 nm值最小，其對應培養孔的顏色與AAM培養基顏色相近。金銀花提取液對A.acidoterrestris的生物膜的形成有較大的影響，低濃度條件下可有效減少生物膜生成量，高濃度時可完全抑制生物膜的生成，且忍冬葉提取液對A.acidoterrestris的生物膜形成能力的影響與金銀花提取液無顯著性差異（P>0.05），這與其對A.acidoterrestris生長曲線的影響結果是相同的（圖2）。細菌的生物膜形成能力代表著細菌處于適宜條件下通過分泌胞外多糖從而達到形成細菌菌落的能力，而生物膜形成能力越強的菌體表面越渾濁，吸光度越大，細胞膜形成能力明顯降低，表明金銀花和忍冬葉提取液能抑制生物膜的形成，對生物被膜具有清除作用。菌體生物被膜主要包括胞外多糖和蛋白質，忍冬提取液對A.acidoterrestris生物膜的抑制作用，可能是提取液中的綠原酸等生物活性成分影響了A.acidoterrestris分泌胞外多糖，菌體內蛋白質組分出現損失，從而使得OD值降低。
圖4忍冬不同部位提取液對酸土脂環酸芽孢桿菌生物膜形成能力的影響
注：（a）：金銀花和忍冬葉提取液處理后酸土脂環酸芽孢桿菌培養液染色后的吸光度；（b）：金銀花和忍冬葉提取液處理后酸土脂環酸芽孢桿菌培養液染色后的圖片。不同大寫字母表示同一部位不同濃度間差異顯著（P<0.05），不同小寫字母表示不同部位同一濃度間差異顯著（P<0.05）。
3.結論
忍冬葉和金銀花中的總酚、總黃酮和綠原酸含量均顯著高于忍冬藤（P<0.05）。三個部位提取液對A.acidoterrestris、S.agalactiae、L.monocytogenes、S.aureus、B.subtilis、E.coli和Salmonella均具有一定的抑制效果，且忍冬葉和金銀花提取液的抑菌效果優于忍冬藤。此外，忍冬葉和金銀花提取液對A.acidoterrestris的抑菌效果最明顯，MIC值均為3.91 mg/mL，MBC值均為31.25 mg/mL，且抑制效果隨提取液濃度的增加而增強。忍冬葉和金銀花提取液能有效抑制A.acidoterrestris菌體生物膜的形成。掃描電鏡結果顯示，忍冬葉和金銀花提取液處理后的A.acidoterrestris菌體形態發生畸變，胞內基質發生泄露。本研究為闡明忍冬抑制A.acidoterrestris的機制奠定了堅實基礎，忍冬有望成為果汁生產中抑制A.acidoterrestris污染的新型高效抑菌劑。但細菌的生物被膜形成能力與營養條件、環境等多種因素有關，因此忍冬對A.acidoterrestris生物膜形成的影響機制還需進一步研究。
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