碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法學(xué)、流程、優(yōu)缺點(diǎn)和結(jié)果判讀（一）
1前言
碳青霉烯類抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等，是治療多重耐藥革蘭陰性菌所致感染最有效的抗菌藥物之一。隨著該類藥物在臨床的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥細(xì)菌（carbapenemresistant organisms，CRO）的檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，其中以肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌為代表。CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)2021年監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，我國(guó)臨床分離肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南的耐藥率分別為23.1%、23%和71.5%[1-2]。由于CRO通常還攜帶對(duì)其他抗菌藥物耐藥的基因，呈廣泛耐藥甚至全耐藥的特征，使臨床的抗感染治療面臨無(wú)藥可用的困境，導(dǎo)致感染患者的高病死率。CRO感染治療面臨的困境急需實(shí)驗(yàn)室開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)[3-11]，多藥聯(lián)合治療可延長(zhǎng)抗菌藥物的使用壽命[12]，體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)證實(shí)兩藥呈協(xié)同或相加作用的聯(lián)合，能有效改善CRO感染患者的病死率。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)可通過(guò)兩藥/多藥組合分析不同藥物之間的協(xié)同抗菌活性，在篩選針對(duì)CRO菌株所致感染的精準(zhǔn)抗感染治療方案中發(fā)揮重要作用。為規(guī)范碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及報(bào)告，上海市微生物學(xué)會(huì)微生物耐藥防控專委會(huì)、CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)和上海市細(xì)菌真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)組織專家對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了討論，撰寫了專家共識(shí)并對(duì)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法和結(jié)果報(bào)告進(jìn)行了推薦，以期對(duì)各醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展針對(duì)CRO菌株的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)及報(bào)告提供幫助。
2 CRO的定義及耐藥機(jī)制
碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacterales）定義為滿足以下任意一個(gè)條件[13]：①對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者。對(duì)于天然對(duì)亞胺培南敏感性降低的細(xì)菌（如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等），需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結(jié)果；②產(chǎn)生碳青霉烯酶。碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）和碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）定義為對(duì)亞胺培南、美羅培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者。產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌目細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最主要的機(jī)制，包括A類絲氨酸碳青霉烯酶（以KPC酶為主）、B類金屬β內(nèi)酰胺酶（以NDM型金屬酶為主）和D類絲氨酸碳青霉烯酶（以O(shè)XA-48型酶為主）。銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制包括AmpC酶高表達(dá)合并外膜滲透屏障、外排泵高表達(dá)以及產(chǎn)生碳青霉烯酶（包括KPC型碳青霉烯酶和金屬β內(nèi)酰胺酶）等。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制是天然產(chǎn)生OXA-23、OXA-24或OXA-51型酶。
3開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的時(shí)機(jī)
僅當(dāng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)菌對(duì)常規(guī)所有測(cè)試的抗菌藥物均耐藥，或臨床醫(yī)師有特殊治療需求時(shí)，開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)篩選可能的多藥聯(lián)合治療方案。開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的時(shí)機(jī)參考圖1。
圖1聯(lián)合藥敏試驗(yàn)時(shí)機(jī)及結(jié)果報(bào)告流程
4聯(lián)合藥敏的方法及其局限性
當(dāng)前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)采用的藥敏試驗(yàn)方法包括肉湯微量稀釋法、肉湯宏量稀釋法、瓊脂稀釋法、E試驗(yàn)法、自動(dòng)化藥敏儀器和紙片擴(kuò)散法。除紙片擴(kuò)散法為定性檢測(cè)方法外，其余均為定量檢測(cè)方法。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法包括肉湯微量稀釋棋盤法、瓊脂稀釋棋盤法、紙條法（包括E試驗(yàn)條和MTS條）、紙片擴(kuò)散法和聯(lián)合殺菌曲線等[16-21]。肉湯微量稀釋棋盤法和瓊脂稀釋棋盤法是聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，但該方法操作繁瑣且基本為手工操作，導(dǎo)致常規(guī)實(shí)驗(yàn)室開展的可操作性差。因此，操作簡(jiǎn)單靈活的紙條法和紙片法不失為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合藥敏可選擇的方法。
專家共識(shí)一：聯(lián)合藥敏試驗(yàn)是臨床微生物室常規(guī)藥敏試驗(yàn)的補(bǔ)充，僅對(duì)多重耐藥菌如碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌或臨床醫(yī)師有特殊治療需求的耐藥菌株進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，其他菌株不建議常規(guī)開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。
專家共識(shí)二：聯(lián)合藥敏試驗(yàn)方法首選肉湯微量稀釋棋盤法，若實(shí)驗(yàn)室無(wú)法開展肉湯微量稀釋棋盤法，可以紙條法或紙片擴(kuò)散法替代。但需注意的是，紙條法或紙片擴(kuò)散法結(jié)果僅供參考，如需確認(rèn)應(yīng)采用肉湯微量稀釋棋盤法。
相關(guān)新聞推薦
1、滸苔多糖降解微生物采集、分離、篩選、鑒定及生長(zhǎng)曲線測(cè)定（三）
2、生活飲用水菌落總數(shù)測(cè)定方法及影響因素（二）