白馬耳組織成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)、冷凍前及復(fù)蘇后存活率、生長曲線繪制（二）
1.2.3烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后存活率測定
當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，按照1.2.1中細(xì)胞傳代方法得到細(xì)胞懸液，通過計(jì)數(shù)得到細(xì)胞總數(shù)。取40μl有2.0x 10個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按照臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)說明書的染色比例加入10μl已過濾的臺盼藍(lán)染液，混勻靜置7min(劉剛等2013)，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)死細(xì)胞數(shù)目(死細(xì)胞呈藍(lán)色)，將其余細(xì)胞在液氮中凍存保存1個(gè)月后解凍，離心后獲得細(xì)胞沉淀，加入5ml培養(yǎng)液制得細(xì)胞懸液，并按上述染色方法進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)及死細(xì)胞數(shù)。通過統(tǒng)計(jì)得到細(xì)胞凍存前、復(fù)蘇后細(xì)胞總數(shù)與死細(xì)胞數(shù)目，并根據(jù)以下公式計(jì)算得到凍存前、復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率=100%[(細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)]。
1.2.4烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的生長曲線繪制
當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，按1.2.1中細(xì)胞傳代方法處理細(xì)胞以得到細(xì)胞懸液，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)。取2.4x105個(gè)細(xì)胞，用24ml培養(yǎng)液混勻后制成細(xì)胞懸液。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種1.0x104個(gè)細(xì)胞，每3孔細(xì)胞為一組，共8組，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24h后每天相同時(shí)間統(tǒng)一計(jì)數(shù)一組細(xì)胞的數(shù)目，通過計(jì)算得出對應(yīng)生長天數(shù)的細(xì)胞總數(shù):細(xì)胞總數(shù)=(細(xì)胞數(shù)/體積)x總體積x稀釋倍數(shù)。按相同方法計(jì)數(shù)8d并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。根據(jù)計(jì)算得到第1至第8天對應(yīng)的細(xì)胞總數(shù)，Biosense微生物生長動(dòng)態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)自動(dòng)繪制細(xì)胞生長曲線圖。依據(jù)以下公式計(jì)算烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞群體倍增時(shí)間:D_{T}=tleft[lg 2/left(lg N_{t}-lg N_{0}right)right]，式中，D_{T}為細(xì)胞倍增時(shí)間，t細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，Nt細(xì)胞培養(yǎng)t時(shí)的細(xì)胞數(shù)目，N0細(xì)胞開始進(jìn)入對數(shù)生長期第1天的細(xì)胞數(shù);依據(jù)以下公式計(jì)算烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞群體倍增次數(shù):X=(lgN2-lgN1)/lg2，式中，N1細(xì)胞接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)目，N2細(xì)胞生長至對數(shù)期末時(shí)的數(shù)目。
通過測定不同時(shí)間烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的數(shù)量，得到細(xì)胞總數(shù)與時(shí)間的關(guān)系，據(jù)此繪制出細(xì)胞的生長曲線圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要繪制每隔3代的細(xì)胞生長曲線圖(Li et al.2020)。
1.2.5烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞的貼壁率測定
本實(shí)驗(yàn)對烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞貼壁率測定，以確定傳代的成纖維細(xì)胞生長、增殖狀態(tài)。在細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，根據(jù)1.2.1中細(xì)胞傳代方法對細(xì)胞進(jìn)行處理，得到細(xì)胞沉淀。1ml培養(yǎng)液充分混勻細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔鋪板處理后加入2ml培養(yǎng)液，均勻接種2x105個(gè)細(xì)胞，重復(fù)3孔，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在細(xì)胞培養(yǎng)6h、12h、24h時(shí)進(jìn)行未貼壁細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)。輕晃細(xì)胞培養(yǎng)板后均勻吸取100μl培養(yǎng)液，利用血球計(jì)數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)3次，按以下公式計(jì)算得細(xì)胞貼壁率，貼壁率=100%[(接種細(xì)胞數(shù)-未貼壁細(xì)胞數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)]。
1.2.6烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞染色體核型
選取處于生長對數(shù)期的細(xì)胞，每1ml原細(xì)胞培養(yǎng)液中添加5μl秋水仙素(20mg/L)，每瓶中加入25μl秋水仙素并置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中處理2.5h使細(xì)胞停在分裂中期(郭晶營等2018)。秋水仙素處理細(xì)胞結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液，按1.2.1中細(xì)胞傳代方法得到細(xì)胞沉淀。加入8mlKCl溶液(0.075mol/L)重懸細(xì)胞沉淀，充分混勻后將離心管放入37℃恒溫水浴鍋中低滲40min。在低滲結(jié)束前1min加入1ml提前預(yù)冷的固定液(甲醛與冰乙酸體積比為3:1)進(jìn)行預(yù)固定。預(yù)固定結(jié)束后離心(1000r/min，10min)收集細(xì)胞沉淀。隨后在離心管中加入8ml已預(yù)冷的固定液重懸細(xì)胞沉淀，輕輕顛倒混勻后置于37℃恒溫水浴鍋中固定30min，離心(1000r/min，10min)得到細(xì)胞沉淀。該步驟重復(fù)3次。得到細(xì)胞沉淀后根據(jù)細(xì)胞量加入300~500μl固定液重懸細(xì)胞沉淀，吹打混勻。在距已預(yù)冷的載玻片垂直距離約為1.6m處使細(xì)胞懸液均勻滴落，再把載玻片放入烘箱中70℃烘干2h，室溫冷卻或室溫干燥12h。使用Giemsa染液(2.5mlGiemsa母液溶于47.5ml超純水中并過濾)染色10~15 min，沖洗掉載玻片背面浮色，自然晾干后即可在顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。
2結(jié)果
2.1烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)觀察
對雄性(圖1a)和雌性(圖1b)烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞原代建系培養(yǎng)。雄性耳組織在培養(yǎng)5~6d時(shí)沿著組織塊附近新長出的紡錘形或三角形細(xì)胞，確定為成纖維細(xì)胞，也有部分細(xì)胞形態(tài)為扁平不規(guī)則多角形，視為上皮細(xì)胞。培養(yǎng)10~12d后，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞匯合度達(dá)到60%且成纖維細(xì)胞優(yōu)勢生長，在顯微鏡下觀察細(xì)胞間有空隙且呈現(xiàn)漩渦狀生長。培養(yǎng)13~15d后，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上。雌性耳組織細(xì)胞生長速度快于雄性耳組織成纖維細(xì)胞，在3d后細(xì)胞沿組織塊周圍長出。雌性耳組織成纖維細(xì)胞形態(tài)及長勢與雄性耳組織成纖維細(xì)胞基本相同，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)及生物學(xué)特性分析。
由于成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比對酶消化液的敏感程度不同，用0.25%胰酶消化液處理，經(jīng)傳代純化培養(yǎng)后，得到較純的成纖維細(xì)胞。雄性和雌性烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞傳代培養(yǎng)(圖2)，均最多培養(yǎng)到80代(P80)。細(xì)胞呈現(xiàn)三角形，隨著細(xì)胞培養(yǎng)代次的增加，細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%以上需要的時(shí)間變長，且細(xì)胞形態(tài)由立體狀三角形形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄讲灰?guī)則多邊形形態(tài)。兩種耳組織成纖維細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)到后期，雄性耳組織成纖維細(xì)胞生長明顯優(yōu)于雌性耳組織成纖維細(xì)胞，且雌性耳組織成纖維細(xì)胞的形態(tài)略微扁平，整體呈現(xiàn)長梭形。
2.2烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞支原體檢測
細(xì)胞培養(yǎng)過程對環(huán)境以及操作步驟的潔凈度要求非常高，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物非常容易因?yàn)椴僮鞑划?dāng)?shù)仍蚨艿轿廴荆瑥亩鴮χ蟮膶?shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，其中，支原體污染較為普遍且不易被發(fā)現(xiàn)，因此選擇培養(yǎng)的耳組織細(xì)胞5代(P5)時(shí)進(jìn)行檢測。被檢測的雄性、雌性耳組織成纖維細(xì)胞均為357bp的單一條帶，與支原體檢測陰性模板一致(圖3)，說明雄性、雌性耳組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過程中均未受到支原體的污染。
Maker.2 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1.支原體檢測陽性模板;2.支原體檢測陰性模板;3.雄性耳組織成纖維細(xì)胞;4.雌性耳組織成纖維細(xì)胞。
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