3株奧默柯達酵母生長曲線、pH耐受性、最適生長溫度測定及對醬油香氣和滋味影響（一）
摘要
柯達酵母屬為華中地區(qū)醬醪醪優(yōu)勢菌屬，為探究其對高鹽稀態(tài)醬油風味和品質(zhì)的影響，從醬醪醪中共分離鑒定共得到10株奧默柯達酵母，且10株酵母均無溶血性。篩選其中3株乙醇積累能力較強的菌株K02、KD13和KD28，對其生長曲線、pH耐受性、最適生長溫度進行研究。3株菌在160g/L鹽質(zhì)量濃度、pH值為4~6、溫度為30℃的條件下生長良好。進一步將高鹽下乙醇及揮發(fā)性風味物質(zhì)代謝能力最強的菌株KD13在醬油釀造中進行添加發(fā)酵應用，理化指標分析顯示，KD13對醬油的還原糖、總酸、氨態(tài)氮含量影響不大，乙醇含量較對照樣提升了11.4%。利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術分析檢出60種揮發(fā)性風味物質(zhì)，添加KD13發(fā)酵的醬油中揮發(fā)性風味物質(zhì)總含量較對照組提升22.18%。利用正交偏最小二乘法判別分析篩選出添加醬油及對照樣中變量投影重要性分析值大于1的差異風味物質(zhì)共計23種，差異風味物質(zhì)隨時間變化的熱圖分析顯示，KD13對醬油中乳酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇以及4-乙基愈創(chuàng)木酚、3-甲硫基丙醛等醬油特征風味物質(zhì)有明顯提升作用。感官評價分析表明，奧默柯達酵母對醬油香氣和滋味有增益作用。該研究為奧默柯達酵母在醬油釀造中的應用奠定了基礎。
1材料與方法
1.1材料與試劑
發(fā)酵3~4月的高鹽稀態(tài)醬醪醪和成品曲，取自華中地區(qū)某醬油廠。
酵母基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；酵母26S rDNA PCR試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；2-甲基-3-庚酮（內(nèi)標物），德國Dr.Ehrenstorfer公司；其他藥品試劑，國藥集團化學試劑有限公司。
溶血性試驗菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術研究中心保藏。
培養(yǎng)基（g/L）：100、160 NaCl的豆芽汁培養(yǎng)基，100、160 NaCl的YPD培養(yǎng)基，脫纖維羊血培養(yǎng)基均參考文獻配制。
1.2儀器與設備
E200型顯微成像系統(tǒng)，尼康映像儀器（上海）有限公司；PE28型pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；722型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；VERITI型梯度PCR擴增儀，美國應用生物有限公司；DYY-12型電泳儀，北京市六一儀器廠；Champ Gel 5000 Plus型凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18型色譜柱，安捷倫科技（中國）有限公司；436GC/EVOQ TQ/PAL型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Bruker Daltonics公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取針，美國Supelco公司；DB-5MS型色譜柱，美國Agilent公司。
1.3實驗方法
1.3.1生香酵母的篩選
發(fā)酵3~4月的高鹽稀態(tài)醬醪醪梯度稀釋后，涂布于含有100 g/L NaCl的豆芽汁固體平板上，30℃培養(yǎng)48~72 h，根據(jù)形態(tài)挑取酵母單菌落，稀釋純化3次，獲得純培養(yǎng)菌株，接種至豆芽汁培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72 h，進行香氣嗅聞。
1.3.2生香酵母的鑒定
采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母模板DNA，PCR擴增，采用20μL體系：模板DNA 1μL，酵母通用引物NL-1（5'-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3'）和NL-4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）各2μL，Taq聚合酶0.5μL，MgCl?溶液1μL，10×PCR buffer 1μL，dNTP 0.5μL，dd H?O補足至20μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，72℃末端延伸7 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純度。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，結(jié)果登錄NCBI進行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.3.3 K.ohmeri產(chǎn)乙醇能力測定
調(diào)整種子液濃度為10?CFU/mL，以1%（體積分數(shù)）接種量接種至豆芽汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d，測定乙醇含量。篩選產(chǎn)乙醇能力最高的3株K.ohmeri進行后續(xù)的發(fā)酵性能研究。
1.3.4 K.ohmeri溶血性實驗
脫纖維羊血培養(yǎng)基冷卻至50℃時添加5%的脫纖維羊血，搖勻后倒入無菌平板冷卻備用。將活化菌無菌操作在平板上劃S形曲線，陽性對照菌培養(yǎng)條件為37℃、24 h，測試菌及陰性對照菌培養(yǎng)條件為30℃、48 h。
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