3株奧默柯達(dá)酵母生長(zhǎng)曲線、pH耐受性、最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定及對(duì)醬油香氣和滋味影響（二）
1.3.5菌種發(fā)酵性能研究
1.3.5.1不同鹽濃度下生長(zhǎng)曲線
調(diào)整種子液OD???=1，以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至不同鹽濃度的豆芽汁液體培養(yǎng)基，每4 h取一次樣測(cè)定發(fā)酵液OD???值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD???值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。
1.3.5.2最適生長(zhǎng)溫度
調(diào)整種子液OD???=1，以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至對(duì)應(yīng)鹽濃度的YPD液體培養(yǎng)基，分別于24、28、30、32、34、37、40℃下培養(yǎng)24 h，以培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵液OD值。
1.3.5.3最適生長(zhǎng)pH值
調(diào)整種子液OD???=1，以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至對(duì)應(yīng)鹽濃度的pH值為1~10的YPD液體培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)24 h，取3 mL發(fā)酵液于5 mL離心管，10 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入3 mL生理鹽水重懸離心洗滌3次，以生理鹽水為空白對(duì)照，測(cè)定OD???值。
1.3.5.4三株K.ohmeri豆芽汁發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定
將3株酵母菌分別挑取一環(huán)接種于160 g/L豆芽汁液體培養(yǎng)基中，在28℃靜置培養(yǎng)7 d后，取菌體培養(yǎng)液置于2 mL的氣質(zhì)進(jìn)樣瓶中測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。
1.3.6添加高鹽稀態(tài)醬醪醪發(fā)酵應(yīng)用
篩選發(fā)酵性能最強(qiáng)的K.ohmeri菌株進(jìn)行添加醬醪醪發(fā)酵的應(yīng)用。高鹽稀態(tài)醬醪醪發(fā)酵采用300 g成品曲與230 g/L的鹽水按料液比1:2（g:mL）混合，30℃發(fā)酵90 d，每日對(duì)醬醪醪進(jìn)行攪拌通氣。調(diào)整KD13種子液菌懸濃度為10?CFU/mL，于發(fā)酵第30天添加至醬醪醪，添加量為5%（體積分?jǐn)?shù)）。以未額外添加風(fēng)味菌的醬醪醪樣為對(duì)照組，取不同發(fā)酵時(shí)間的醬醪醪經(jīng)濾布過(guò)濾后獲得醬油。
1.3.7分析方法
1.3.7.1醬油理化指標(biāo)測(cè)定
乙醇含量的測(cè)定參考GB 5009.225-2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》中的密度瓶法。還原糖測(cè)定參照GB 5009.7-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》，總酸、氨態(tài)氮測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》。
1.3.7.2揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定
參考JIANG等固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS）的方法對(duì)醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。
1.3.7.3醬油感官評(píng)定
參考JIANG醬油感官評(píng)價(jià)的方法。
1.4數(shù)據(jù)處理及繪圖
利用MegaX繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；利用Excel進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算；利用Origin 2023進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化；利用SPSS Statistics 26進(jìn)行差異顯著性分析；利用Omicstudio繪制熱圖；利用SIMCA 14.1進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）。所有的試驗(yàn)采用3個(gè)平行。
2結(jié)果與分析
2.1耐鹽產(chǎn)乙醇K.ohmeri的篩選、鑒定及安全性
2.1.1醬醪醪中耐鹽生香酵母的篩選、分子生物學(xué)鑒定
由于柯達(dá)酵母屬在醬油發(fā)酵的3~4月占比最高，因此選擇發(fā)酵3~4月的高鹽稀態(tài)醬醪醪采樣，一共分離得到21株純培養(yǎng)酵母菌株，其形態(tài)特征及豆芽汁發(fā)酵液嗅聞結(jié)果如表1所示。21株酵母的豆芽汁發(fā)酵液具有花果香、酒香、醇香等香氣特征。對(duì)所分離的生香酵母進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖1所示，共獲得4個(gè)種，分屬4個(gè)屬，柯達(dá)酵母數(shù)量最多（10株），且均為K.ohmeri，其余為魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）（6株）、埃切假絲酵母（Starmerella etchellsii）（4株）、多變擬威克酵母（Wickerhamiella versatilis）（1株）。
表1菌株編號(hào)形態(tài)香氣嗅聞結(jié)果
K02、KD01、KD02、KD03、KD04、KD05、KD10、KD13、KD28、KD30單菌落呈白色，較厚，表面干燥有褶皺，邊緣不平整，為花瓣?duì)睿患?xì)胞呈橢圓形，有假菌絲香氣呈濃郁的花果香及酒香
K11、K14、K15、K16、K17、K19單菌落呈乳白色，較厚，表面較干燥，邊緣光滑呈圓形；細(xì)胞呈圓形或橢圓形香氣呈較濃郁的花果香
K08單菌落呈乳白色，表面濕潤(rùn)，邊緣光滑呈圓形；細(xì)胞呈橢圓形香氣較淡，有花果香
K01、K02、K04、K06單菌落呈乳白色，表面濕潤(rùn)，邊緣光滑呈圓形；細(xì)胞呈橢圓形香氣淡，有花果香
2.1.2 K.ohmeri產(chǎn)乙醇能力比較
醬油中的醇類(lèi)物質(zhì)以乙醇為主，主要由耐鹽酵母代謝產(chǎn)生。乙醇能賦予醬油愉悅的醇香，是形成乙酯的重要底物，且對(duì)醬油有一定的防腐作用。由于醬油發(fā)酵周期長(zhǎng)，因此采用鹽質(zhì)量濃度為100 g/L的豆芽汁培養(yǎng)基替代醬醪醪發(fā)酵快速判斷菌株的產(chǎn)乙醇能力。
由圖2可知，10株不同的K.ohmeri乙醇產(chǎn)量均大于1%（體積分?jǐn)?shù)），KD13、KD28和K02產(chǎn)量較高，分別為1.30%、1.19%和1.19%。
2.1.3 K.ohmeri的溶血性
發(fā)酵食品中的微生物若產(chǎn)生溶血毒素會(huì)對(duì)人體造成一定危害，因此必須對(duì)食品發(fā)酵菌株進(jìn)行溶血安全性測(cè)試。劉爽等對(duì)醬油發(fā)酵用菌Z.rouxii的安全性（溶血性）進(jìn)行了研究。以S.aureus為陽(yáng)性對(duì)照，S.cerevisiae為陰性對(duì)照，對(duì)10株K.ohmeri進(jìn)行溶血性測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。10株菌均未產(chǎn)生草綠色色環(huán)（α溶血）或透明溶血環(huán)（β溶血），表明10株酵母均無(wú)溶血性，無(wú)溶血風(fēng)險(xiǎn)，可以進(jìn)一步開(kāi)展研究。
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