鴿源大腸桿菌分離株對(duì)13種抗菌藥物耐藥現(xiàn)狀研究（一）
摘要:為調(diào)查廣東某肉鴿場(chǎng)大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)的流行情況以及耐藥性，該研究從肉鴿直腸內(nèi)容物中分離大腸桿菌并進(jìn)行鑒定，采用瓊脂稀釋法對(duì)分離得到的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，通過PCR檢測(cè)分離株攜帶的耐藥基因。結(jié)果顯示，150份樣品共分離到120株大腸桿菌;藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離株對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林等13種抗菌藥物不同程度耐藥，其中74株大腸桿菌分離株存在多重耐藥情況;PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)具有耐藥表型的菌株攜帶qnrS、blaTEM、blaCTX-M、blaVIM、aacC4和sul1 6種耐藥基因。上述結(jié)果表明，大腸桿菌分離株對(duì)13種抗菌藥物不同程度耐藥，存在多重耐藥現(xiàn)象，且攜帶多種耐藥基因。該研究可為廣東省鴿源大腸桿菌的流行情況、耐藥現(xiàn)狀及臨床合理用藥提供參考。
引言(Introduction)
近年來，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)水平的提高以及特禽飼養(yǎng)業(yè)的快速發(fā)展，肉鴿養(yǎng)殖煥發(fā)出蓬勃生機(jī)，養(yǎng)殖模式由散養(yǎng)向規(guī)模化、集約化方向發(fā)展。隨著養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)變、養(yǎng)殖數(shù)量的增加、養(yǎng)殖密度的增大，再加上養(yǎng)殖環(huán)境的污染，這都促使大腸桿菌病成為危害肉鴿養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要細(xì)菌性傳染病之一，給養(yǎng)鴿業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。各種日齡的鴿均可感染大腸桿菌，主要經(jīng)呼吸道、消化道引起鴿的腹瀉、敗血癥等局部或者全身性感染，以乳鴿、童鴿、青年鴿的發(fā)病較為嚴(yán)重，且死亡率高。
由于E.coli血清型眾多且不同血清型之間的交叉保護(hù)作用有限，實(shí)際生產(chǎn)中疫苗的使用效果不盡人意，因此抗菌藥物依然是目前防治鴿大腸桿菌病的主要措施，但隨著抗菌藥物的長(zhǎng)期不合理使用，E.coli的耐藥性逐年增加，尤其對(duì)傳統(tǒng)抗菌藥物如氨芐西林、磺胺甲噁唑等的耐藥率逐年上升，并且出現(xiàn)多重耐藥菌株和超級(jí)耐藥菌株，極大提高了臨床大腸桿菌病的防控難度。E.coli又可以作為耐藥基因的儲(chǔ)藏庫(kù)，能以不同途徑將其攜帶的耐藥基因進(jìn)行傳播，或隨食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全。
隨著不同種類抗菌藥物的廣泛使用，E.coli亦隨即對(duì)不同種類抗菌藥物產(chǎn)生出不同的耐藥機(jī)制。E.coli染色體攜帶耐藥突變基因gyrA和parC以及可水平轉(zhuǎn)移的qnrS基因可介導(dǎo)其對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBLs)是當(dāng)前E.coli耐藥性問題的最主要因素，可使β-內(nèi)酰胺類藥物中的β-內(nèi)酰胺環(huán)活性降低，使其產(chǎn)生耐藥，由質(zhì)粒編碼的CTX-M型ESBLs不僅對(duì)青霉素類耐藥，而且對(duì)二、三、四代頭孢菌素類藥物的耐藥性也較高。E.coli對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥最普遍的機(jī)制就是產(chǎn)生藥物功能基團(tuán)滅活酶或稱修飾酶(核苷轉(zhuǎn)移酶ANT、乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC、磷酸轉(zhuǎn)移酶APH)，可使氨基糖苷類藥物的一些結(jié)構(gòu)被修飾、滅活從而產(chǎn)生耐藥性。磺胺類藥物耐藥性的產(chǎn)生主要是二氫葉酸合成酶的生成，使E.coli被抑制的程度下降而產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生這種酶通常與Sul1、Sul2、Sul3這三種耐藥基因有關(guān)。腸桿菌對(duì)黏菌素的耐藥性可能是與染色體機(jī)制和(或)質(zhì)粒攜帶的移動(dòng)黏菌素抗性基因(mcr)有關(guān)，質(zhì)粒介導(dǎo)耐黏菌素歸因于mcr基因，包括mcr-1到mcr-10。
本研究通過無菌方法采集新鮮病死鴿直腸內(nèi)容物、分離細(xì)菌并進(jìn)行大腸桿菌鑒定，采用瓊脂稀釋法對(duì)分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，通過PCR檢測(cè)分離株攜帶的常見重要耐藥基因，為規(guī)模化肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌的流行情況、耐藥現(xiàn)狀及臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。
1材料與方法(Materials and Methods)
1.1主要材料
?病料:來源于廣東某規(guī)模化肉鴿場(chǎng)疑似細(xì)菌感染的新鮮病死鴿150只。
?主要試劑:
?LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
?大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922，由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。
?抗菌藥物包括環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、氨芐西林(Ampicillin,AMP)、阿莫西林克拉維酸(Amoxicillin Clavulanic acid,AMC)、頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、亞胺培南(Imipenem,IPM)、阿米卡星(Amikacin,AMI)、慶大霉素(Gentamicin,GEN)、甲氧芐啶(Trimethoprim,TMP)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ)、黏菌素(Colistin,CL)、氯霉素(Chloramphenicol,CHL)、磷霉素(Fosfomycin,FOS)等13種，均購(gòu)自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司。
?2xFast Taq plus PCR Master、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料、瓊脂糖、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，均購(gòu)自廣州市銳成生物科技有限公司。
?主要儀器:
?超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。
?BOD生化培養(yǎng)箱、恒溫震蕩培養(yǎng)箱，均購(gòu)自廣州恒創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。
?MALDI TOF MS質(zhì)譜儀，購(gòu)自日本島津公司。
?PCR擴(kuò)增儀，購(gòu)自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司。
?電泳儀，購(gòu)自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。
?凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司。
1.2細(xì)菌的分離與鑒定
?細(xì)菌的分離純化:無菌采集適量病死鴿直腸中段內(nèi)容物，置于裝有1.0mL PBS的EP管中，震蕩搖勻靜置后取50μL上清液于麥康凱瓊脂平板上，涂布棒涂抹均勻，置37℃培養(yǎng)16-18h，觀察分離菌株的形態(tài)特征。然后用接種環(huán)挑選平板上單個(gè)紅色圓形菌落采用“Z”字連續(xù)劃線法再次接種到麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)直至純化。挑選純化后的單個(gè)菌落接種于LB肉湯中，37℃培養(yǎng)16-18h，獲得分離株純培養(yǎng)物，保存?zhèn)溆谩?
?分離株的鑒定:將獲得的分離株純培養(yǎng)物送至華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，采用MALDI TOF MS質(zhì)譜儀進(jìn)行菌株鑒定。
1.3耐藥表型檢測(cè)
以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922為質(zhì)控菌株，采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦使用的瓊脂稀釋法測(cè)定大腸桿菌分離株的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)，并依據(jù)歐盟藥敏試驗(yàn)委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定。
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