微生物生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用：釀酒酵母II號(hào)染色體合成及生長(zhǎng)曲線圖分析
酵母是與人類生活關(guān)系最密切的一類單細(xì)胞真核微生物，在啤酒、面包的制作中不可或缺。自然界分布有超過(guò)1500種酵母，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是最早被廣泛用于食品發(fā)酵、疫苗生產(chǎn)等現(xiàn)代工業(yè)的酵母菌，是名副其實(shí)的“細(xì)胞工廠”；同時(shí)因?yàn)槠淝逦倪z傳背景，成為科學(xué)研究最常用的模式生物之一。早在1996年，完成了釀酒酵母全基因組測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)酵母基因組總共約6000個(gè)基因中有5000個(gè)不是維持生命活動(dòng)所必需的，可以進(jìn)行刪減和改寫。隨著合成DNA技術(shù)的快速發(fā)展，大尺度重編基因組與人工合成成為可能。近幾年，科學(xué)家通過(guò)非生命的化學(xué)物質(zhì)組裝成染色體，研究導(dǎo)致細(xì)胞死亡、細(xì)胞失活、生長(zhǎng)缺陷的各項(xiàng)關(guān)鍵要素，探索生命本質(zhì)。2010年，Gibson等人合成了首個(gè)原核生命體（生殖道支原體，Mycoplasma mycoides），而更復(fù)雜的真核基因組的序列設(shè)計(jì)與合成，已成為國(guó)際上合成基因組領(lǐng)域亟待突破的技術(shù)瓶頸。為此，研究團(tuán)隊(duì)人工設(shè)計(jì)并再造了釀酒酵母II號(hào)染色體，并深入解析了合成染色體生物學(xué)功能。
實(shí)驗(yàn)步驟
BY4741、BY4742和synⅡ三種酵母菌加入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，Biosense微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)測(cè)量各類細(xì)菌的OD值以便獲取其生長(zhǎng)曲線圖，培養(yǎng)過(guò)程中搖晃15秒后然后隔20分鐘測(cè)試一個(gè)OD（600nm）從而獲得幾種酵母菌的生長(zhǎng)曲線圖。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本論文主要就酵母的染色體synⅡ進(jìn)行研究?？焖侔l(fā)展的DNA合成技術(shù)已經(jīng)成為一種可以在基因組規(guī)模上進(jìn)行重組的“構(gòu)建-tounderstand”方法。本論文的研究中實(shí)現(xiàn)了對(duì)770-千堿基合成酵母染色體II(synII)的完成，并發(fā)現(xiàn)SynII的特點(diǎn)是具有廣泛的跨組學(xué)，盡管SynII結(jié)構(gòu)發(fā)生了相當(dāng)大的變化，但synII與野生型幾乎沒(méi)有區(qū)別，并且通過(guò)恢復(fù)轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)基因拷貝數(shù)，可以觀察到對(duì)轉(zhuǎn)譯機(jī)制的上調(diào)。
圖1、synII和BY4741的細(xì)胞周期對(duì)比顯示的百分比。帶有分離的CEN2-GFP點(diǎn)、中期紡錘波和后期紡錘波的細(xì)胞。(B)復(fù)制配置synII(紅色)和BY4741(black)通過(guò)深度基因測(cè)序顯示的相對(duì)拷貝數(shù)。(C)RNA序列分析表明，synII中轉(zhuǎn)譯機(jī)械的顯著上調(diào)是由synII中tRNA基因的缺失引起的。
圖2、synII染色體的表型分析。圖A表示的是synII在不同介質(zhì)上的表型測(cè)試。圖B表示的是synIIA-R,synIIR-Y的生長(zhǎng)曲線圖以及synII菌株與BY4741和BY4742菌株生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖。圖C表示的是synII與BY4741菌株的細(xì)胞周期比較圖。圖像顯示了細(xì)胞在不同階段的細(xì)胞形態(tài)。圖D顯示synII細(xì)胞與分離的CEN2-GFP點(diǎn)(中期)的百分比。在細(xì)胞周期中紡錘波和后期紡錘波。每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少計(jì)算了200個(gè)細(xì)胞，表示的是synII和BY4741菌株中期到后期細(xì)胞的總比。圖D表示的是SynII(紅色)和BY4741(black)復(fù)制時(shí)間表示，所得的數(shù)據(jù)通過(guò)深度測(cè)序的相對(duì)拷貝數(shù)計(jì)算。
圖3、synll染色體貫穿組學(xué)剖面分析（BY4741作為對(duì)比參照物）設(shè)計(jì)對(duì)細(xì)胞生理學(xué)的影響很小，只表現(xiàn)為適度的上調(diào)。其中trna采用的是去除觸發(fā)的轉(zhuǎn)譯機(jī)制(A到D)。如圖顯示，圖A表示的是synII細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組水平、(B)synII細(xì)胞的蛋白組水平、(C和D)synII細(xì)胞的代謝組與BY4741細(xì)胞對(duì)比。在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組中，差異表達(dá)的總數(shù)量(P<0.001)也呈現(xiàn)出來(lái)，圖中對(duì)應(yīng)上調(diào)和下調(diào)的特征分別用紅色和綠色標(biāo)注。圖(E)表示的是通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組在酵母菌中表達(dá)的富集途徑和表達(dá)剖面圖，上調(diào)的特征用紅色標(biāo)注，下調(diào)的特征用綠色標(biāo)注。圖(F)表示的對(duì)synII的RNAseq分析和無(wú)tRNA序列的基因序列分析。通過(guò)添加synII染色體的tRNA陣列。對(duì)于(E)和(F)其顯著性水平由熱圖顏色強(qiáng)度和符號(hào)大小表示。上調(diào)和下調(diào)的功能以紅色和綠色標(biāo)注。
總結(jié)：雖然過(guò)去幾十年人們對(duì)于酵母的研究很多，但是我們對(duì)這種模式生物的理解仍然有限。本論文主要就酵母的synⅡ染色體進(jìn)行了深度功能分析，首先就a-770的成酵母菌染色體的合成進(jìn)行研究，同時(shí)完成了對(duì)該染色體的基因測(cè)序等相關(guān)工作。論文研究過(guò)程中我們有針對(duì)性調(diào)試的酵母的起源發(fā)展缺陷，通過(guò)使用Biosense微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)研究了含有synⅡ染色體的酵母和其他種類的酵母在甘油培養(yǎng)基37°C生長(zhǎng)情況，通過(guò)對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)曲線分析，不同種類的酵母菌株盡管存在著細(xì)微的差別，這也說(shuō)明了含有synII染色體的酵母菌株顯示出高度一致的生物學(xué)過(guò)程，可與原生菌株相媲美，這也表明Biosense微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)是在基因編輯領(lǐng)域也存在著很大的應(yīng)用前景。
綜上，合成釀酒酵母II號(hào)染色體，是國(guó)際合成釀酒酵母基因組計(jì)劃(Sc 2.0)中重要組成部分。開(kāi)啟“設(shè)計(jì)生命、再造生命和重塑生命”的進(jìn)程，使我國(guó)成為繼美國(guó)之后第二個(gè)掌握真核生物基因組設(shè)計(jì)構(gòu)建能力的國(guó)家。合成型釀酒酵母菌株可實(shí)現(xiàn)在多種壓力環(huán)境中超速進(jìn)化，為合成酵母菌株的工業(yè)化應(yīng)用方向注入新的動(dòng)力，并有望在人類健康、生態(tài)、能源、工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響（Yeast 2.0,Nature Communications專輯）。
相關(guān)新聞推薦
1、廣西牛肺炎支原體病原的分離和鑒定、藥敏實(shí)驗(yàn)分析（下）
2、腸桿菌、大腸桿菌、大腸菌群三者有什么區(qū)別？如何區(qū)分開(kāi)來(lái)？
3、胞內(nèi)菌分類|sRNA對(duì)胞內(nèi)菌生長(zhǎng)的調(diào)控作用（一）