低鹽發(fā)酵甜瓣子體系中產(chǎn)生物胺的菌株與降解菌株能力研究【下】
3結(jié)果與分析
3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線
生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線如表3所示，其回歸系數(shù)R2均≥0.998，可滿足檢測(cè)要求。
表3生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線
3.2產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果
3.2.1產(chǎn)胺菌株初篩結(jié)果由于生物胺顯堿性，產(chǎn)胺菌株在顯色培養(yǎng)基中呈現(xiàn)紫色，不產(chǎn)生物胺或降解生物胺菌株在顯色培養(yǎng)基上不變色。過(guò)夜培養(yǎng)后得到培養(yǎng)基變紫的初篩菌株如圖1a所示，挑取這些菌株進(jìn)行分離、純化，如圖1b所示，得到產(chǎn)胺菌株46株。
圖1產(chǎn)胺菌株顯色培養(yǎng)基顯色形態(tài)（a）及LB平板培養(yǎng)形態(tài)（b）
3.2.2產(chǎn)胺菌株復(fù)篩結(jié)果將初篩菌株接種至生物胺液體顯色培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，篩選培養(yǎng)后培養(yǎng)液為紫色的菌株為產(chǎn)胺菌株，如圖2所示，篩選得到32株產(chǎn)胺菌。
通過(guò)固體顯色培養(yǎng)基初篩，液體顯色培養(yǎng)基復(fù)篩，再經(jīng)過(guò)16S rDNA、18S rDNA和ITS測(cè)序，通過(guò)BLAST比對(duì)序列，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。
圖2產(chǎn)胺菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
結(jié)果顯示甜瓣子中所篩選出代謝生物胺的菌株主要為芽孢桿菌屬、短桿菌屬、腸桿菌屬及少量小孢根霉，這與Jeon等[15]發(fā)現(xiàn)韓國(guó)傳統(tǒng)豆醬Cheonggukjang中，主要由腸球菌屬和芽孢桿菌屬生成生物胺的研究結(jié)果一致。
3.2.3高效液相色譜測(cè)定培養(yǎng)液中生物胺含量經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，得到復(fù)篩的產(chǎn)胺菌株培養(yǎng)液中生物胺含量如圖3所示。
圖3產(chǎn)胺菌株培養(yǎng)液中生物胺含量（mg/mL）
結(jié)合空白組進(jìn)行分析可以得出，所篩出菌株培養(yǎng)液中生物胺總量均遠(yuǎn)高于空白組中生物胺總量，不同菌株之間產(chǎn)生物胺能力存在較大差異，與空白組相比芽孢桿菌屬產(chǎn)組胺、酪胺的能力相對(duì)較強(qiáng)。其中，B11菌株產(chǎn)苯乙胺能力相對(duì)較強(qiáng)，含量達(dá)78.4 mg/kg；B16菌株產(chǎn)酪胺能力相對(duì)較強(qiáng)，含量達(dá)25.3 mg/kg。Y17菌株和Y20菌株具備較強(qiáng)的產(chǎn)腐胺、尸胺能力，其培養(yǎng)液中含量分別達(dá)257.5 mg/kg和92.8 mg/kg，挑選這4株菌株回接至甜瓣子發(fā)酵體系驗(yàn)證產(chǎn)胺能力。
3.3高產(chǎn)胺菌株回接至不同鹽度甜瓣子模擬體系中產(chǎn)生物胺的能力
高產(chǎn)生物胺菌株回接結(jié)果如圖4所示。可看出，6%鹽度體系中生物胺含量遠(yuǎn)高于9%和12%鹽度體系，且8種生物胺均有檢出，生物胺總量最高達(dá)4 207.6 mg/kg。對(duì)照組發(fā)酵過(guò)程主要產(chǎn)酪胺、腐胺、組胺和色胺，有少量尸胺檢出。該鹽度下，除B11號(hào)菌株外其余各菌株體系中生物胺總量均高于食品中生物胺建議總量1 000 mg/kg[16]。其中，B16回接體系中酪胺含量相對(duì)較高，含量為1 194.4 mg/kg，高于Ten等[17]、Nout等[18]提出的食品中酪胺為100～800 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)；Y17體系中腐胺含量較高，含量為3 363.9 mg/kg；Y20回接體系中高產(chǎn)尸胺，為1 160.4 mg/kg，表明6%鹽度發(fā)酵甜瓣子可能存在較大安全風(fēng)險(xiǎn)。
圖4高產(chǎn)胺菌株回接6%、9%、12%鹽度甜瓣子模擬體系后產(chǎn)胺能力
在9%和12%含鹽量甜瓣子樣品中，生物胺總量最高分別為233.9，781.2 mg/kg，其生物胺組成相似。9%鹽度下B11高產(chǎn)苯乙胺220.06 mg/kg；12%鹽度下B11高產(chǎn)腐胺119.4 mg/kg、苯乙胺546.5 mg/kg，遠(yuǎn)高于30 mg/kg的推薦量[17]。B16、Y17、Y20菌株在9%、12%鹽度回接體系中不產(chǎn)色胺，產(chǎn)生物胺種類和含量隨鹽度增加而減少，與對(duì)照組生物胺變化趨勢(shì)較為一致，可能是鹽對(duì)其生長(zhǎng)起到了一定程度的抑制作用所致。精胺和亞精胺在不同含鹽量甜瓣子樣品中含量均較低。因此，實(shí)現(xiàn)甜瓣子低鹽化發(fā)酵不能一味的追求降低鹽的含量。
3.4生物胺降解菌株篩選結(jié)果
3.4.1不產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果挑選46株課題組前期從甜瓣子中篩選出的不同種屬菌株，活化后接種至生物胺液體顯色培養(yǎng)基中，篩選得到39株不產(chǎn)生物胺的菌株，主要為酵母菌、乳酸菌（表4）。
表4不產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果
3.4.2生物胺降解菌株初篩結(jié)果將上述不產(chǎn)胺菌株未變紫培養(yǎng)液衍生后于300 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，初篩出降胺菌株。熒光檢測(cè)篩選結(jié)果如圖5所示。
圖5降胺菌株初篩熒光檢測(cè)結(jié)果
選取熒光強(qiáng)度弱于空白組的菌株，初步斷定為降解生物胺菌株（圖5），共篩選出降解生物胺菌株9株，其中酵母菌4株，乳酸菌4株，細(xì)菌1株。
3.4.3生物胺降解菌株復(fù)篩結(jié)果將上述菌株回接至生物胺質(zhì)量濃度為100 mg/L的BAs培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)12 h后，空白組未觀察到菌株的生長(zhǎng)，其余組菌株均有生長(zhǎng)，于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，從而判定其在以生物胺為唯一氮源的培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如圖6所示。
圖6降解生物胺菌株BAs培養(yǎng)液OD值
研究結(jié)果表明，初步篩選的9株菌均具備降解生物胺的能力。其中，美極梅奇酵母23J-5、食竇魏斯氏菌1R8S39在BAs培養(yǎng)基下生長(zhǎng)狀況較好，表明其降解生物胺的能力可能較高。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，9株菌株熒光強(qiáng)度均弱于空白組的菌株（圖7），表明其均為生物胺降解菌。
圖7生物胺降解菌株熒光檢測(cè)結(jié)果
3.4.4降胺菌株BAs培養(yǎng)液降解能力測(cè)定使用高效液相色譜測(cè)定各菌株BAs培養(yǎng)液生物胺含量并計(jì)算其降解率，結(jié)果如圖8所示。所篩選菌株都具有一定生物胺降解能力，然而均無(wú)法降解亞精胺，不同菌株降解不同種類生物胺的能力差異較大。9株菌株對(duì)色胺的降解率在14.10%～21.37%之間；苯乙胺的降解率在5.94%～20.09%之間；腐胺的降解率在14.46%～24.94%之間；尸胺的降解率在23.52%～30.82%之間；組胺的降解率在5.65%～33.43%之間；酪胺的降解率在4.75%～15.10%之間；精胺的降解率在34.67%～65.58%之間；其中，扣囊復(fù)膜酵母MTQ1004具備較強(qiáng)的降解腐胺、組胺、精胺能力，其降解率分別為24.94%，33.43%，65.58%；美極酶奇酵母23J-5具備較強(qiáng)的降解尸胺、酪胺能力，降解率分別為30.82%，15.10%；香腸乳桿菌F003具備較強(qiáng)的降解苯乙胺和色胺能力，降解率分別為20.09%，21.37%，且能降解除亞精胺外的其余7種生物胺。通過(guò)比較分析可知，扣囊復(fù)膜酵母（MTQ1004）和香腸乳桿菌（F003）的生物胺降解率相對(duì)較高，與楊利昆等[19]、趙佳迪[11]研究結(jié)果較為一致。
圖8降胺菌株BAs培養(yǎng)液的生物胺降解率（%）
3.5降胺菌株回接甜瓣子模擬體系驗(yàn)證結(jié)果
3.5.1降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的降解能力測(cè)定將上述降胺菌株回接至含100 mg/L生物胺的甜瓣子模擬體系中培養(yǎng)16 d，提取衍生后，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定生物胺含量，結(jié)果如圖9所示。由于尖包念珠菌為有害菌，因此不考慮回接應(yīng)用。其中，降胺能力最強(qiáng)的是香腸乳桿菌F003，與前期篩選結(jié)果一致，其對(duì)苯乙胺的降解率高達(dá)100%，對(duì)危害較大的組胺、酪胺和精胺的降解率分別可達(dá)57.61%，25.52%，45.99%；扣囊復(fù)膜酵母MTQ1004對(duì)苯乙胺和腐胺的降解率達(dá)100%，對(duì)組胺降解率為37.78%；其余菌株對(duì)各種生物胺均有一定的降解能力。
圖9甜瓣子模擬體系中的生物胺降解率（%）
在甜瓣子模擬體系下，菌株降解率與對(duì)應(yīng)菌株降解生物胺能力強(qiáng)弱較為一致。而降解生物胺種類數(shù)量減少，這與該菌株降解生物胺能力特性有所不同，可能是因?yàn)樘鸢曜诱０l(fā)酵時(shí)，環(huán)境因素對(duì)菌株降解生物胺能力造成影響所致[20]。
3.5.2降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的感官評(píng)價(jià)由圖10可以看出，在回接純種發(fā)酵體系中，所篩選出降胺菌株發(fā)酵的甜瓣子感官評(píng)價(jià)結(jié)果存在一定差異。其中，生物胺降解能力較強(qiáng)的扣囊復(fù)膜酵母MTQ1004具有生物胺降解能力，而強(qiáng)化發(fā)酵的甜瓣子霉味較重，以腐臭味、氨味為主，感官品質(zhì)相對(duì)較差；生物胺降解菌株香腸乳桿菌F003強(qiáng)化發(fā)酵所得的甜瓣子同正常發(fā)酵的甜瓣子相比，其酯香、醬香味較濃，所得甜瓣子樣品感官品質(zhì)最佳，可以考慮用作低鹽化甜瓣子中的降胺發(fā)酵菌株。
圖10降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的感官評(píng)價(jià)
4結(jié)論
本研究從4%鹽度甜瓣子中篩出產(chǎn)生物胺菌株32株，其中腸桿菌屬Y17、小孢根霉Y20、枯草芽孢桿菌B11和B16產(chǎn)生物胺能力最強(qiáng)，主要產(chǎn)酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺。鹽度對(duì)菌株產(chǎn)生物胺能力有明顯抑制作用，將4株菌株回接至甜瓣子發(fā)酵體系中，其中6%發(fā)酵體系含有大量生物胺，9%和12%發(fā)酵體系中產(chǎn)生物胺明顯得到抑制。
篩選出降解生物胺菌株9株；篩選出1株可用于甜瓣子低鹽化發(fā)酵的降胺菌株香腸乳桿菌F003，它能有效降解苯乙胺、組胺、酪胺和精胺等生物胺，在生物胺含量為100 mg/L時(shí)，降解率分別為100%，57.61%，25.52%，45.99%，且回接體系中感官品質(zhì)最佳，具有較好的生長(zhǎng)能力，可考慮為甜瓣子低鹽發(fā)酵時(shí)的降胺菌株。
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