?大腸桿菌生長曲線的測定、來源OMVs的分離純化
大腸桿菌生長曲線的測定：
將-80℃保存的大腸桿菌甘油凍存液，按1︰100的比例接種到5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm/min條件下培養(yǎng)使菌液OD600值為0.6左右。配制兩瓶100mL無菌的LB培養(yǎng)基，按1︰100的比例將OD600值為0.6左右的種子菌液接種到100mL無菌LB培養(yǎng)基中，其中一瓶不接種，作為陰性對照組。
于37℃、200rpm/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h取出1mL菌液，在96孔板中每孔加入200μL菌液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在酶標(biāo)儀中檢測OD600值，制作大腸桿菌的生長曲線。經(jīng)測定后的大腸桿菌生長曲線如圖2所示，分析大腸桿菌的生長曲線后可以得出，0-3h為大腸桿菌延緩期，4-14h為大腸桿菌對數(shù)生長期，16-22h為大腸桿菌穩(wěn)定生長期，22h之后為大腸桿菌衰亡期。選取大腸桿菌處在穩(wěn)定生長期的初期階段，進(jìn)行大腸桿菌來源OMVs的分離純化。
大腸桿菌來源OMVs的分離純化：
按1︰100的比例，將100μL大腸桿菌甘油凍存液接種到10mL無菌LB培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8h。取上述250μL大腸桿菌種子液接種到250mL無菌LB培養(yǎng)基中，分別接種2瓶含有250mL無菌LB培養(yǎng)基，于37℃、200rpm/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h，使大腸桿菌處于穩(wěn)定生長期的初期階段。收集處于穩(wěn)定生長期初期階段的大腸桿菌培養(yǎng)液500mL，首先在4℃，15000g條件下離心20min去除大腸細(xì)菌后取上清液，然后將收集的上清液過0.45μm濾膜去除雜質(zhì)后收集上清液，再次將收集的上清液過0.22μm濾膜后收集上清液，最后將上清液經(jīng)100kD濾膜進(jìn)行超濾處理，去除蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，用200μL無菌PBS溶液溶解沉淀物，得到大腸桿菌來源OMVs的濃縮液。分別對大腸桿菌來源OMVs進(jìn)行透射電鏡和粒徑分布測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。透射電鏡結(jié)果表明大腸桿菌來源OMVs是含有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，同時(shí)粒徑檢測結(jié)果表明大腸桿菌來源OMVs的平均粒徑為130.4nm，粒徑分布范圍為20-200nm。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用物理過濾的方法成功獲得了大腸桿菌來源OMVs。
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