摩加夫芽孢桿菌在防治水稻稻瘟病方面的應(yīng)用進(jìn)展
水稻是世界上最重要的糧食作物，但水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)一直受到病蟲(chóng)害的制約。而稻瘟病是一種由子囊真菌稻瘟菌引起的世界性的水稻病害，是全世界稻區(qū)危害最嚴(yán)重的水稻病害之一。
由于稻瘟病的危害性與流行性，給水稻的產(chǎn)量帶來(lái)了巨大的損失，因此有效防治水稻稻瘟病是提高水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵。在當(dāng)今社會(huì)主要依靠化學(xué)農(nóng)藥與抗性品種選育的方式來(lái)防治稻瘟病。近年來(lái)利用微生物來(lái)解決植物病害受到越來(lái)越多的關(guān)注。
生物防治通常是指利用活體微生物或者其代謝活性物質(zhì)防治病原菌、害蟲(chóng)和雜草以及調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的措施來(lái)預(yù)防或治療植物的病害，其具有效果穩(wěn)定明顯、對(duì)環(huán)境的選擇壓力較小且不易使靶標(biāo)病原菌產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，是一種新型安全高效的植物病害防治方式，可以有效地解決水稻稻瘟病高抗品種和化學(xué)農(nóng)藥在生產(chǎn)上的局限性。
其中芽孢桿菌分布廣泛、環(huán)境耐受力強(qiáng)、可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，且芽孢桿菌生防菌劑穩(wěn)定性及相容性較強(qiáng)，是目前用于植物病害生物防治研究最多的一類(lèi)生防細(xì)菌。芽孢桿菌以其耐熱抗逆，環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)成為近年生物防治研究的熱點(diǎn)，目前已經(jīng)報(bào)道的防治農(nóng)作物病害的芽孢桿菌有很多，比如枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，但摩加夫芽孢桿菌在生物防治方面的報(bào)道還較少。
同時(shí)雖然生防芽孢桿菌抗病害的研究已經(jīng)取得了較多成果，但生防產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程仍然任重道遠(yuǎn)。在產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中，既要攻克生防菌發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方以及最適于繁殖的生長(zhǎng)條件等產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等關(guān)鍵技術(shù)。解決上述問(wèn)題需要技術(shù)所有者和生產(chǎn)單位付出更多的時(shí)間和精力，才可能實(shí)現(xiàn)生防技術(shù)從研究成果向批量生產(chǎn)，乃至于實(shí)際應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
鑒于此，針對(duì)上述問(wèn)題，深入研究，遂有本案產(chǎn)生。
下面提供一種芽孢桿菌MTC-8菌種制備方法及其應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出摩加夫芽孢桿菌在生物防治方面的應(yīng)用上有不足，生防菌生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方以及最適于繁殖的生長(zhǎng)條件等產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等關(guān)鍵技術(shù)仍有待突破的問(wèn)題。
菌種材料：摩加夫芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）MTC-8，稻瘟菌菌株Guy11、Guy11-eGFP。
水稻材料：麗江新團(tuán)黑谷（LTH），臺(tái)北309（TP309）。
將實(shí)驗(yàn)室前期獲得的水稻內(nèi)生菌及附生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，收集可培養(yǎng)細(xì)菌332株，真菌及芽孢桿菌128株。將這些菌與稻瘟菌進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，先在制作好的CM平板上接種稻瘟病菌菌塊，恒溫培養(yǎng)4d后，在平板四周距稻瘟菌菌塊20mm處接種分離出的細(xì)菌，28℃恒溫倒置培養(yǎng)，2d后觀察并記錄有抑菌活性的菌株，篩選拮抗菌株。
經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)篩選水稻內(nèi)生菌及附生菌中的拮抗菌株，發(fā)現(xiàn)有抑制稻瘟病菌生長(zhǎng)效果的拮抗菌株5株，根據(jù)其拮抗稻瘟病菌的效果，選取其中拮抗活性最強(qiáng)的菌種MTC-8進(jìn)行后續(xù)實(shí)施例研究。
在NCBI網(wǎng)站上找到BLAST功能，將拮抗菌的序列上傳至網(wǎng)站并用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)搜索，比對(duì)結(jié)果顯示拮抗菌MTC-8的16SrDNA序列與摩加夫芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）的16SrDNA序列同源性最高，兩者的相似度在99%以上，再利用MEGA5.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。
MTC-8菌液培養(yǎng)時(shí)間的篩選
MTC-8生長(zhǎng)曲線測(cè)定：按2%的接種量將MTC-8種子液加入到100mL滅菌后的玉米粉蛋白胨培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min震蕩培養(yǎng)，分別取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h的菌液測(cè)其吸光度（OD600），繪制生長(zhǎng)曲線，以確定菌體數(shù)量最多的培養(yǎng)時(shí)間。
菌液中的菌體量取決于其培養(yǎng)時(shí)間，需要選擇菌液中菌落數(shù)量最大且穩(wěn)定，并產(chǎn)生芽孢最多的時(shí)期用作微生物菌劑的配制。細(xì)菌的整個(gè)生長(zhǎng)期包括延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)穩(wěn)定期及衰亡期，菌株MTC-8的生長(zhǎng)曲線如圖所示，MTC-8的延遲期較短，12h后開(kāi)始進(jìn)入增殖狀態(tài)并迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在48h時(shí)菌落數(shù)達(dá)到最大，48h~72h時(shí)菌落數(shù)量進(jìn)入穩(wěn)定期，72h后菌落數(shù)量顯著下降，進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期。菌液培養(yǎng)時(shí)間在微生物菌劑的制作中發(fā)揮著重要作用，若培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，菌液中的菌體總數(shù)過(guò)少，且未能形成芽孢，菌體活性低，菌容易死亡；若培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體活性降低且容易產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。因此，在本實(shí)施例中可選擇生長(zhǎng)穩(wěn)定期48h~72h為菌液培養(yǎng)時(shí)間。
MTC-8芽孢率測(cè)定：按2%的接種量將MTC-8種子液加入到100mL滅菌后的玉米粉蛋白胨培養(yǎng)基中，于28℃、180r/min震蕩培養(yǎng)48h、60h、72h，備用。取三張潔凈的載玻片，選取合適位置分別滴加上述培養(yǎng)時(shí)間的菌液，用鑷子夾住載玻片于酒精燈外焰烘烤片刻，使菌液干燥并將菌種固定。向載玻片滴加數(shù)滴5%孔雀綠染色液覆蓋涂菌部位，于酒精燈加熱至染液冒蒸汽但并不沸騰并維持10min，加熱時(shí)注意補(bǔ)充染液，切勿讓染液干涸。待其略冷卻后，使用無(wú)菌水沖洗至無(wú)明顯染液脫出為止。滴加番紅染色液涂菌部位復(fù)染約2min，無(wú)菌水沖洗至至無(wú)明顯染液脫出為止。待干燥后油鏡觀察，菌體呈紅色，芽孢呈綠色。每個(gè)樣品取3個(gè)視野計(jì)數(shù)，在油鏡下計(jì)數(shù)芽孢個(gè)數(shù)及總體菌數(shù)，芽孢生成率=芽孢數(shù)/總菌數(shù)×100%。
為進(jìn)一步確定MTC-8菌液培養(yǎng)時(shí)間，使用孔雀綠-番紅染色法對(duì)培養(yǎng)48h、60h、72h的MTC-8菌液進(jìn)行染色，并對(duì)視野中的芽孢率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果：菌體呈紅色，芽孢呈綠色，48h、60h、72h的菌液中均產(chǎn)生了芽孢。對(duì)不同時(shí)間的芽孢產(chǎn)生率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，72h時(shí)芽孢產(chǎn)生率最高，為66.7%，綜合上述結(jié)果，選取培養(yǎng)時(shí)間為72h的菌液制作MTC-8生防菌劑。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MTC-8微生物菌劑在田間對(duì)稻瘟病有良好的防治效果，預(yù)防效果要好于治療效果，其病斑數(shù)相較對(duì)照組減少了一半以上，和稻瘟靈防效相當(dāng)。
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