巨大芽孢桿菌BM24生長(zhǎng)曲線、耐藥性、益生潛力評(píng)估及藥敏試驗(yàn)（二）
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1芽孢桿菌分離
取新鮮糞便放入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，渦旋混勻，水浴鍋80℃加熱處理20 min，靜置后取100μL上清液接種于LB肉湯中，37℃下恒溫培育18 h，梯度稀釋，取10-4、10-5和10-6稀釋度的菌液于LB瓊脂平板上涂布，倒置培養(yǎng)。挑出不同形態(tài)的單菌落，接種純化3代，直至平板上的菌落形狀、大小、顏色一致，采用革蘭氏染色與芽孢染色法觀察形態(tài)，鏡檢篩選出形態(tài)呈桿狀且有內(nèi)生孢子的菌株，將其菌液與60%滅菌甘油等體積混合，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?
1.2.2分離菌株生化鑒定
使用HBI芽孢桿菌生化鑒定條對(duì)分離菌株進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定，鑒定結(jié)果與《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌手冊(cè)》比對(duì)。
1.2.3分離菌株16S rRNA基因序列分析
參考水煮法提取細(xì)菌DNA作為PCR擴(kuò)增模板，細(xì)菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')用于PCR擴(kuò)增鑒定，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增體系:Premix Taq 10μL，上、下游引物各0.5μL，基因組DNA 5μL，ddH2O 4μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min;擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果上傳于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，分析其種屬。
1.2.4分離菌株的益生潛力評(píng)估
1.2.4.1耐酸性
調(diào)整LB肉湯的pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，滅菌后備用。將凍存的分離菌株接種至LB肉湯，37℃、180 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)，按1%的接種量接入不同pH的LB肉湯中，37℃搖床培養(yǎng)4 h后吸取200μL菌懸液至酶標(biāo)板中，于酶標(biāo)儀檢測(cè)其在600 nm處的吸光度(OD600)值，以LB肉湯(pH 7.0)為對(duì)照，測(cè)量樣品分為3份，每份重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算菌株相對(duì)存活率。
相對(duì)存活率(%)=(試驗(yàn)組OD600值/對(duì)照組OD600值)×100。
1.2.4.2耐膽鹽
配制分別含有0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的LB肉湯備用。將凍存的分離菌株接種至LB肉湯，37℃、180 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)，按1%的接種量接入不同膽鹽濃度的LB肉湯中，37℃搖床培養(yǎng)4 h后吸取200μL菌懸液至酶標(biāo)板中，于酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD600值，以不添加膽鹽的LB肉湯為對(duì)照，測(cè)量樣品分為3份，每份重復(fù)測(cè)定3次，按照1.2.4.1中公式計(jì)算菌株相對(duì)存活率。
1.2.4.3藥敏試驗(yàn)
采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定分離菌株對(duì)青霉素G、萬(wàn)古霉素、鏈霉素等15種抗菌藥物的抗生素敏感性。取100μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌懸液均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上，再將所選藥敏片貼在培養(yǎng)基表面，并輕輕壓實(shí)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)量藥敏片周圍抑菌圈直徑大小來(lái)判斷菌株的藥物敏感性。結(jié)果判定參照《紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T 125-1999)。
1.2.4.4溶血活性
使用無(wú)菌脫纖維綿羊血制備綿羊血平板備用。分離菌株活化后在綿羊血平板上劃線，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)溶血環(huán)。
1.2.4.5抗菌活性
采用牛津杯法測(cè)定分離菌株的抗菌活性。將病原菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌)均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，將牛津杯放置于LB瓊脂平板上，輕輕按壓，在牛津杯中加入200μL(108 CFU/mL)分離菌株的菌懸液，37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)定抑菌圈直徑。
1.2.5生長(zhǎng)曲線
取過(guò)夜培養(yǎng)的菌懸液，按1%的接種量接入LB肉湯中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h取菌懸液1次，共取12次，以無(wú)菌LB肉湯為對(duì)照，利用微生物生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定OD600值，重復(fù)測(cè)定3次，繪制生長(zhǎng)曲線。
1.2.6體內(nèi)安全性
參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定的《直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評(píng)價(jià)指南》對(duì)分離菌株進(jìn)行安全性評(píng)估。
1.2.6.1灌胃
10只小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后隨機(jī)分為2組，對(duì)照組灌胃生理鹽水(0.2 mL/只)，試驗(yàn)組灌胃活菌數(shù)為108 CFU/mL的分離菌株(0.2 mL/只)，持續(xù)灌胃14 d。小鼠自由采食和飲水。每日灌胃前記錄小鼠的體重變化，同時(shí)觀察小鼠毛色、整體精神狀態(tài)及分泌物、排泄物狀況。灌胃結(jié)束后，采集小鼠血液，進(jìn)行血細(xì)胞指標(biāo)分析;將小鼠安樂(lè)死后取肝臟、脾臟、腎臟，無(wú)塵紙擦干表面水分后稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。
臟器指數(shù)(%)=[臟器重(g)/體重(g)]×100。
1.2.6.2腹腔注射
10只小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后隨機(jī)分為2組，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/只)，試驗(yàn)組腹腔注射活菌數(shù)為108 CFU/mL的分離菌株(0.2 mL/只)，小鼠自由采食和飲水，僅在第1天注射，觀察小鼠毛色、整體精神狀態(tài)及分泌物、排泄物狀況，連續(xù)觀察7 d。7 d后將小鼠安樂(lè)死，解剖觀察各組織器官是否存在病理變化。
1.3數(shù)據(jù)處理與分析
試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，GraphPad Prism 8作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。
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