菌株雙控制生長開關及其應用的遺傳穩(wěn)定性（二）
3.具有雙控制的生長開關能夠獲得較高的生產(chǎn)產(chǎn)量
研究人員用編碼酵母中甘油合成途徑基因的pUC57-Gly質粒轉化WT、SC和DC菌株，分別得到菌株WT-Gly、SC-Gly和DC-Gly。這些菌株按照先前的實驗方法進行培養(yǎng)。此外，我們在生長培養(yǎng)基中加入卡芐西林，以確保質粒的維持。去除IPTG后，SC和DC菌株生長停滯，取常規(guī)樣品，測量甘油和葡萄糖濃度。
在WT-Gly菌株的情況下，葡萄糖在培養(yǎng)15小時后被完全消耗掉（圖3a）。在葡萄糖的指數(shù)增長過程中，細菌產(chǎn)生甘油，甘油在葡萄糖耗盡后被同化。兩種生長受阻的菌株消耗葡萄糖的速度較慢（圖3b，c）。培養(yǎng)24 h后，SC-Gly菌株消耗了開始時供應的大部分葡萄糖，DC-Gly菌株消耗了實驗開始時供應的所有葡萄糖。而且，這兩種菌株都不能同化所產(chǎn)生的甘油。
大腸桿菌中的天然甘油消耗途徑在葡萄糖存在下沒有活性，這是由于甘油激酶的碳分解代謝物阻遏。此外，pUC57‐Gly質粒上攜帶的酵母甘油生產(chǎn)途徑是不可逆的。因此，葡萄糖耗盡后甘油的同化需要在大腸桿菌途徑中重新合成酶，由于RNA聚合酶表達抑制后轉錄活性的強烈降低，這在這個階段不再可能。相比之下，葡萄糖攝取和代謝所必需的酶在實驗開始時就已經(jīng)存在了。
WT-Gly菌株的甘油產(chǎn)量定義為在細胞攝取葡萄糖的時間間隔內產(chǎn)生的甘油量除以消耗的葡萄糖量，為0.33ggly/gglc。為了計算SC-Gly和DC-Gly菌株的產(chǎn)量，在生長停滯后測定葡萄糖消耗和甘油產(chǎn)量。與預期的一樣，生長抑制細菌的甘油產(chǎn)量分別高于WT細菌，分別為0.55和0.41。
盡管SC和DC這兩種工程菌株之間有很小的差異，但一旦生長被關閉，DC-Gly菌株與WT-Gly菌株相比，甘油產(chǎn)量有顯著改善。綜上所述，在外部表達控制下添加rpoA的遺傳冗余保留了資源從生長重新分配甘油生物合成的可能性。
4.具有雙重控制的生長開關在遺傳上是穩(wěn)定的
生長停滯的菌株處于強大的選擇壓力下，任何恢復RNA聚合酶表達的突變體，即使是低水平的，也能夠生長并最終接管種群。先驗地，有兩種方式可能損害生長開關的功能，并且細菌可以逃脫生長控制。首先，lacI序列的突變可能導致無功能的轉錄阻遏物。第二，T5啟動子區(qū)的突變可能使LacI與T5啟動子的結合效率降低。最初的SC設計中，通過在染色體中插入兩個額外的lacI拷貝，可以大大降低第一個風險，而通過將單一控制進化為DC設計，可以解決第二個風險。在DC菌株的情況下，當細菌突變三個(天然和額外的)lacI拷貝或rpoA和rpoBC上游的兩個lac操縱子序列時，才可以發(fā)生逃逸。
研究人員通過實驗測試了DC菌株的遺傳穩(wěn)定性是否確實比SC菌株有所改善。對于這兩種生長控制菌株，從分離的克隆中隆中進行了40次重復培養(yǎng)：在IPTG存在的情況下進行預培養(yǎng)，然后將預培養(yǎng)物洗滌并再稀釋到不含IPTG的培養(yǎng)基中。使用豐富的（LB）培養(yǎng)基進行預培養(yǎng)，以獲得大的種群，從而增加突變的可能性。讓培養(yǎng)物進化，并在24小時和96小時后計算逃逸種群的數(shù)量。逃逸種群能夠在生長停滯的條件下生長，即在沒有IPTG的情況下生長。
圖4生長開關設計的遺傳穩(wěn)定性。通過對(a)SC株和(b)DC株進行40次重復培養(yǎng)，評估其遺傳穩(wěn)定性。對于每種培養(yǎng)物，測量了不同時間、24h（藍色）和96h（紅色）的光密度，并與WT對照的光密度進行比較
實驗結果如圖4所示。雖然在24 h后SC菌株沒有檢測到逃逸現(xiàn)象，但是超過80%的培養(yǎng)物達到了與培養(yǎng)96 h后WT菌株觀察到的高光密度（圖4a）。對一些但不是所有的這些逃逸子的測序顯示了rpoBC啟動子區(qū)域的關鍵突變。特別是，在LacI與啟動子區(qū)域結合的一些lacO序列中發(fā)現(xiàn)了核苷酸替換。之前有報道稱，這些替換導致LacI的結合親和力更低，在原始序列親和力的<1%到2%之間。由于這些突變，即使在沒有IPTG的情況下，rpoBC操縱子也可以表達。相反，無論是在24h后還是在96 h后，DC應變都沒有發(fā)生逃逸現(xiàn)象事件（圖4b）。這表明，與原有生長開關的單對照設計相比，改進后的雙對照設計的遺傳穩(wěn)定性有了很大的提高
5.雙控制生長開關穩(wěn)定性的提高并不會降低其生存能力
DC菌株的遺傳穩(wěn)定性是通過進一步修改細菌的必要轉錄機制獲得的。這些額外的修飾可能會影響細胞的活力，即一旦誘導劑在一段時間的生長停滯后被重新供應，它們就具能重新開始生長。在生長階段和生產(chǎn)階段之間進行迭代的可能性在生物技術過程中是很重要的。因此，研究人員對SC和DC菌株進行了活性試驗，并比較了結果。
通過經(jīng)典的擴散平板法評估了生長受阻細菌的生存能力。在24小時后，取SC和DC群體的常規(guī)樣本，在相同的IPTG培養(yǎng)基中預培養(yǎng)后，再稀釋到含葡萄糖和不含IPTG的M9培養(yǎng)基中。樣品被稀釋到已知的生物量，并分散在含有IPTG的固體瓊脂平板表面。對單個菌落進行計數(shù)，并在每個時間點通過將每生物量CFU與在相同培養(yǎng)基中使用IPTG的同一菌株的每生物量CFU歸一化來量化其活力。
圖5具有單控制（SC）或雙控制（DC）生長開關的菌株的生存能力。活力表示為SC菌株(橙色)和DC菌株(藍色)的每克生物量CFU與在相同條件下使用IPTG生長的同一菌株的每克生物量CFU的歸一化
從圖5中可以看出，SC和DC菌株的生存能力評分沒有顯著性差異。對于兩株菌株，在沒有IPTG的情況下，活力呈指數(shù)下降，15 h后穩(wěn)定在0.01左右。這意味著，與在IPTG存在下生長的相同菌株相比，只有1%的細胞在長時間的生長停滯后能夠恢復生長。相反，在相同的IPTG條件下培養(yǎng)的SC和DC菌株恢復生長的能力并沒有隨著時間的推移而下降。
討論：
生物具有通過突變和適應約束而進化的能力。對于世代時間短、種群規(guī)模大的細菌來說尤其如此，這使得它們能夠快速進化。雖然這一特性在自然界中是相關的，但當涉及到用于生物技術應用的修飾細菌菌株時，它提出了一個挑戰(zhàn)。由于微生物本身就不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)意想不到的行為，因此可能導致工程遺傳功能的喪失。有害突變的發(fā)生對于控制細菌生長的合成回路尤為重要，因為失去控制可能會在生長受阻的種群中帶來明顯的適應度優(yōu)勢。
為此，研究人員基于之前的生長開關，添加了RNA聚合酶的另一個亞單位α被置于用于控制ββ’亞單位表達的同一lac系統(tǒng)的控制之下，從而顯著增加了生長開關及其應用的遺傳穩(wěn)定性。
在生長和生長停滯之間轉換的可能性提高了持續(xù)代謝物生產(chǎn)的前景，包括生物量產(chǎn)生之后、生長停滯和代謝物生產(chǎn)的周期。當生物過程在惡劣條件下進行時，所提出的方法特別有益，因為RNA聚合酶調節(jié)可以提高細胞對酸性、高溫和高鹽濃度的耐受性。然而，為了使生長和生長停滯的重復循環(huán)實際可行，需要用其他方法取代IPTG的化學誘導，例如光遺傳學。此外，還可以控制生物合成途徑的表達，以強調生長和生物合成之間的解離。這可以通過一個正交的表達系統(tǒng)來實現(xiàn)，如T7RNA聚合酶，這將允許細胞繼續(xù)合成生物合成所需的酶，即使生長受到抑制。此外，使用最優(yōu)和反饋控制方法與光遺傳誘導相結合，可以精確確定生長和生長停滯階段的持續(xù)時間，從而獲得產(chǎn)量和生產(chǎn)力之間的預期權衡。通過對RNA聚合酶的冗余控制而獲得的生長開關的穩(wěn)定性增加，是通過這些擴展實現(xiàn)對代謝物生產(chǎn)的連續(xù)、動態(tài)控制的必要前提。
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