納米銀的制備方法及對小麥赤霉病菌抗菌活性的影響（二）
2結果與分析
2.1納米銀的制備與表征
利用化學還原法制備納米銀，納米銀溶液顏色呈亮黃色。納米銀在400 nm左右出現了很強的吸收峰(圖1A)，這是典型的10?20 nm納米銀的紫外特征吸收峰。進一步通過TEM表征，納米銀為類似球形、粒徑為5?30 nm的顆粒(圖1B)。
圖1納米銀粒子的UV-vis吸收光譜圖(A)及TEM圖(B)
2.2納米銀的抑菌活性
納米銀對小麥赤霉病菌的抑制效果見表1。結果表明，納米銀能抑制病原真菌的生長，抑制率隨著濃度的增加而增大。其中，10μg/mL的納米銀對小麥赤霉病菌抑制率高達93.9%，說明病原真菌對納米銀的敏感性很強。對各處理間的不同濃度進行方差分析和Duncan檢驗，結果表明，病原真菌的各處理間差異達到極顯著水平(<0.01)。
納米銀對病原真菌的毒力回歸方程為=1.256+5.289 2，50為0.59μg/mL，2為0.975 5。可見，納米銀對小麥赤霉病菌的抑制作用比較強。病原真菌的毒力回歸方程的相關系數2大于0.9，說明其曲線與實際擬合程度相當好。
2.3納米銀對菌體內保護酶活性的影響
2.3.1納米銀處理時間對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響：隨著納米銀處理時間的延長，SOD酶活出現先升高后下降的變化趨勢。SOD酶活從2 h開始迅速上升，4 h的酶活達到最大，是對照組的5.20倍，隨著時間的推移，活性開始下降，10 h的酶活最低，為對照組的63.12%(圖2)。方差分析表明，SOD酶活性對納米銀相對敏感，隨著處理時間的不同，受納米銀的影響存在著顯著性差異。
圖2納米銀處理時間對SOD活性的影響
2.3.2納米銀處理時間對過氧化物酶(POD)活性的影響：POD對照組活性與SOD對照組表現出相似的變化情況，隨著處理時間的增加不斷升高。處理組的POD活性隨著時間的延長同樣呈現先升高后下降的趨勢，在4 h達到最大值，為對照組的1.05倍，與SOD活性最高值出現在4 h相同，在10 h達到最小值，為對照組的14.85%(圖3)。2、4、6、8、10 h各處理組POD活性相比差異顯著。
2.3.3納米銀處理時間對過氧化氫酶(CAT)活性的影響：對照組CAT酶活在試驗時間內，呈上升趨勢，納米銀對小麥赤霉病菌的CAT酶活性出現先升高后下降的變化，與SOD、POD活性呈現出相似的變化趨勢，4 h的CAT酶活出現最大值，處理組的CAT活性一直低于對照組(圖4)。與其他處理時間的活性相比差異顯著。
圖3納米銀處理時間對POD活性的影響
圖4納米銀處理時間對CAT活性的影響
2.4納米銀對菌體內MDA含量的影響
處理組MDA含量呈現先升高后降低的趨勢，在6 h時，迅速上升至最高值1.40 nmol/g，為對照組的2.41倍，6 h后開始出現下降趨勢，10 h降至最低，為對照組的1.05倍。對照組在2?10 h，呈現平緩的上升趨勢，10 h出現最大值，但始終低于處理組(圖5)。
圖5納米銀處理時間對MDA含量的影響
2.5納米銀對菌體內電導率的影響
隨著處理時間的推移，納米銀處理后的小麥赤霉病菌溶液的導電率2?6 h之內呈現上升趨勢，6 h出現最大值，為對照組的1.09倍，6 h之后，導電率開始下降，10 h出現最小值，為對照組的98.89%。細胞膜一旦受到破壞，膜透性就會增大，從而使細胞內的電解質外滲。上述結果說明，經納米銀處理后，小麥赤霉病菌的細胞膜受到破壞，隨著處理時間的增長，菌體膜的完整性喪失，電解質出現外滲，電導率最終出現下降的現象(圖6)。
圖6納米銀處理時間對電導率含量的影響
2.6納米銀對菌體內可溶性蛋白含量的影響
納米銀處理組和對照組的可溶性蛋白含量均呈現降低的趨勢。處理組蛋白含量隨著時間的延長不斷降低，在10 h出現最低值，為1.27 mg/g，是對照組的56.69%。對照組蛋白含量在開始時也出現降低的情況，但始終高于處理組，且降低速率低于處理組(圖7)。
圖7納米銀處理時間對蛋白含量的影響
2.7納米銀對菌體內可溶性糖含量的影響
納米銀各處理組和對照組的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量呈現同樣的降低現象。處理組糖含量隨著時間的增加不斷降低，6 h到10 h下降緩慢，在10 h出現最低值，為0.40 mg/g，是對照組的92%。對照組在整個實驗過程中與處理組趨勢接近，但含量始終高于處理組(圖8)。
圖8納米銀處理時間對糖含量的影響
3討論
納米銀能顯著抑制小麥赤霉病菌的生長，50為0.59μg/mL。納米銀的抑制作用與其濃度成正比，隨著濃度的增大而增大。10μg/mL納米銀的抑菌率達到93.9%。Zhao等合成了一種新型的10-Hydroxycanthin-6-one抗菌劑，表明其對小麥赤霉病菌有很強的抑制活性，50μg/mL的10-Hydroxycanthin-6-one酯類衍生物7s(10-hydroxycanthin-6-one R=CH3CH3)化合物能完全抑制病原菌的生長，10-meoxycanthin-6-one、10-Hydroxycanthin-6-one酯類衍生物7s(10-Hydroxycanthin-6-one R=CH3)和7t(10-Hydroxycanthin-6-one R=CH3CH2)化合物的最小抑菌濃度在3.91μg/mL到31.25μg/mL之間。陸云等研究了4種殺菌劑(氟環唑、己唑醇、甲基硫菌靈和南寧霉素毒立)對小麥赤霉病菌的抑制作用，發現氟環唑和己唑醇對病原真菌的抑制效果最好，其50分別是0.201 5μg/mL和0.235 6μg/mL；其次是甲基硫菌靈，50是5.115 7μg/mL；南寧霉素毒力最弱，其50是389.313 24μg/mL。因此，納米銀較一些殺菌劑有相當或更好的抑菌效果，有望成為一種新型納米殺菌劑。
納米銀處理小麥赤霉病菌2?10 h，菌體內SOD、POD和CAT的活性隨著處理時間的延長均呈現先上升后下降的趨勢，在4 h達到最高值。結果表明，納米銀在抑菌過程中，影響了菌體內3種酶的活性。原因可能是隨著脅迫程度的增強，氧自由基不斷積累，為了適應環境，增強本身對脅迫的抵御能力，菌體的酶促系統中SOD、POD、CAT等活性也會相應發生變化，這是正常生理性抗逆反應。然而菌體細胞在抵御過程中受到了破壞，所以酶的活性出現下降，細胞瀕臨死亡，從而造成菌體的生長受到抑制。通過研究納米銀對3種保護酶活性的影響，得出破壞病原菌的膜保護系統是納米銀抑菌的機制之一。
有研究認為，正常情況下細胞中SOD、POD和CAT 3種保護酶協調一致，可以防止過多自由基造成的細胞毒害，一旦細胞內自由基所處動態平衡被破壞，細胞就有可能受到損傷。當細胞受到外界刺激時，SOD能夠嵌入到線粒體基質中，防止細胞中產生過量的活性氧。CAT能夠防止體內過多H2O2的產生，降低細胞發生氧化的可能性。POD能催化其他物質的同時，將H2O2還原為H2O。SOD、POD和CAT作為生物體內重要的抗氧化酶類，能夠降低對細胞膜起損傷作用的活性氧自由基，防止細胞受到破壞。由此可知，當病原真菌受到納米銀的刺激時，會產生一系列的防御反應，當細胞內活性氧的生成能力超過其清除能力，導致3種保護酶的活性出現暫時升高的現象，但因活性氧自由基的不斷增多，導致細胞受到破壞，進一步抑制菌體的生長，使3種酶的活力開始逐漸下降。高櫞等研究了月腺大戟根總黃酮對尖孢鐮刀菌3種酶活性的影響，發現了同樣的變化趨勢。魏立強等研究了旱芹粗提物對棉花枯萎病菌保護酶活性的影響，結果表明，隨著納米銀處理時間的增加，菌體內的SOD、POD和CAT活性同樣出現先上升后下降的變化趨勢。因此，病原真菌體內3種保護酶系統的活性被破壞，損害活性氧自由基清除系統，導致細胞膜系統的完整性嚴重損傷，從而使菌體受到一定程度的破壞。
小麥赤霉病菌經納米銀處理后，病原菌的可溶性蛋白和糖含量降低，病原菌MDA含量和電導率出現先升高后下降的趨勢。計紅芳等研究絨白乳菇發酵液提取物對楊樹葉枯病菌MDA含量的影響，發現同樣的變化趨勢。隨著納米銀處理時間的增加，小麥赤霉病菌細胞膜受到破壞，蛋白質的結構出現水解和變性，膜結構的破壞，使得MDA不斷積累，從而出現升高趨勢，電導率由于電解質外滲，同樣出現升高的現象。電導率升高，表明菌絲體浸出液壓力增加，可能是浸出液中存在滲漏的內含物，而滲漏是由于菌絲細胞膜透性遭到了破壞。隨著菌體脂質過氧化程度的加劇，細胞膜的完整性喪失，進一步使得MDA和電導率出現下降趨勢。納米銀可以顯著抑制病原菌的活性，說明該物質可以嚴重破壞病原菌的抗氧化系統，使得蛋白質和糖類水解，進而使細胞膜系統受到損傷，細胞滲透性加強，最終導致細胞死亡。通過研究納米銀對小麥赤霉病菌保護酶活性的影響，為納米銀抗真菌機理以及抑菌應用提供理論依據，為防治植物真菌病害提供參考。為了進一步了解納米銀對真菌的抑菌機理，仍需要進行分子水平上的研究。
4結論
納米銀能顯著抑制小麥赤霉病菌的生長，抑制作用隨著濃度的增加而不斷增大，10μg/mL的納米銀對病原菌的抑制率達90%以上，50為0.59μg/mL。
隨著納米銀處理時間的增長，3種酶的活性均出現先增加后降低的變化。SOD、POD、CAT均在4 h出現最高值，10 h降至最低。納米銀提高菌體內丙二醛含量，降低可溶性蛋白和可溶性糖含量。
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