納米銀的制備方法及對(duì)小麥赤霉病菌抗菌活性的影響（二）
2結(jié)果與分析
2.1納米銀的制備與表征
利用化學(xué)還原法制備納米銀，納米銀溶液顏色呈亮黃色。納米銀在400 nm左右出現(xiàn)了很強(qiáng)的吸收峰(圖1A)，這是典型的10?20 nm納米銀的紫外特征吸收峰。進(jìn)一步通過(guò)TEM表征，納米銀為類似球形、粒徑為5?30 nm的顆粒(圖1B)。
圖1納米銀粒子的UV-vis吸收光譜圖(A)及TEM圖(B)
2.2納米銀的抑菌活性
納米銀對(duì)小麥赤霉病菌的抑制效果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，納米銀能抑制病原真菌的生長(zhǎng)，抑制率隨著濃度的增加而增大。其中，10μg/mL的納米銀對(duì)小麥赤霉病菌抑制率高達(dá)93.9%，說(shuō)明病原真菌對(duì)納米銀的敏感性很強(qiáng)。對(duì)各處理間的不同濃度進(jìn)行方差分析和Duncan檢驗(yàn)，結(jié)果表明，病原真菌的各處理間差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)。
納米銀對(duì)病原真菌的毒力回歸方程為=1.256+5.289 2，50為0.59μg/mL，2為0.975 5。可見(jiàn)，納米銀對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用比較強(qiáng)。病原真菌的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)2大于0.9，說(shuō)明其曲線與實(shí)際擬合程度相當(dāng)好。
2.3納米銀對(duì)菌體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響
2.3.1納米銀處理時(shí)間對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響：隨著納米銀處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD酶活出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)。SOD酶活從2 h開(kāi)始迅速上升，4 h的酶活達(dá)到最大，是對(duì)照組的5.20倍，隨著時(shí)間的推移，活性開(kāi)始下降，10 h的酶活最低，為對(duì)照組的63.12%(圖2)。方差分析表明，SOD酶活性對(duì)納米銀相對(duì)敏感，隨著處理時(shí)間的不同，受納米銀的影響存在著顯著性差異。
圖2納米銀處理時(shí)間對(duì)SOD活性的影響
2.3.2納米銀處理時(shí)間對(duì)過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響：POD對(duì)照組活性與SOD對(duì)照組表現(xiàn)出相似的變化情況，隨著處理時(shí)間的增加不斷升高。處理組的POD活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)同樣呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在4 h達(dá)到最大值，為對(duì)照組的1.05倍，與SOD活性最高值出現(xiàn)在4 h相同，在10 h達(dá)到最小值，為對(duì)照組的14.85%(圖3)。2、4、6、8、10 h各處理組POD活性相比差異顯著。
2.3.3納米銀處理時(shí)間對(duì)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響：對(duì)照組CAT酶活在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，呈上升趨勢(shì)，納米銀對(duì)小麥赤霉病菌的CAT酶活性出現(xiàn)先升高后下降的變化，與SOD、POD活性呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，4 h的CAT酶活出現(xiàn)最大值，處理組的CAT活性一直低于對(duì)照組(圖4)。與其他處理時(shí)間的活性相比差異顯著。
圖3納米銀處理時(shí)間對(duì)POD活性的影響
圖4納米銀處理時(shí)間對(duì)CAT活性的影響
2.4納米銀對(duì)菌體內(nèi)MDA含量的影響
處理組MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在6 h時(shí)，迅速上升至最高值1.40 nmol/g，為對(duì)照組的2.41倍，6 h后開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，10 h降至最低，為對(duì)照組的1.05倍。對(duì)照組在2?10 h，呈現(xiàn)平緩的上升趨勢(shì)，10 h出現(xiàn)最大值，但始終低于處理組(圖5)。
圖5納米銀處理時(shí)間對(duì)MDA含量的影響
2.5納米銀對(duì)菌體內(nèi)電導(dǎo)率的影響
隨著處理時(shí)間的推移，納米銀處理后的小麥赤霉病菌溶液的導(dǎo)電率2?6 h之內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，6 h出現(xiàn)最大值，為對(duì)照組的1.09倍，6 h之后，導(dǎo)電率開(kāi)始下降，10 h出現(xiàn)最小值，為對(duì)照組的98.89%。細(xì)胞膜一旦受到破壞，膜透性就會(huì)增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲。上述結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)納米銀處理后，小麥赤霉病菌的細(xì)胞膜受到破壞，隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，菌體膜的完整性喪失，電解質(zhì)出現(xiàn)外滲，電導(dǎo)率最終出現(xiàn)下降的現(xiàn)象(圖6)。
圖6納米銀處理時(shí)間對(duì)電導(dǎo)率含量的影響
2.6納米銀對(duì)菌體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響
納米銀處理組和對(duì)照組的可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。處理組蛋白含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷降低，在10 h出現(xiàn)最低值，為1.27 mg/g，是對(duì)照組的56.69%。對(duì)照組蛋白含量在開(kāi)始時(shí)也出現(xiàn)降低的情況，但始終高于處理組，且降低速率低于處理組(圖7)。
圖7納米銀處理時(shí)間對(duì)蛋白含量的影響
2.7納米銀對(duì)菌體內(nèi)可溶性糖含量的影響
納米銀各處理組和對(duì)照組的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量呈現(xiàn)同樣的降低現(xiàn)象。處理組糖含量隨著時(shí)間的增加不斷降低，6 h到10 h下降緩慢，在10 h出現(xiàn)最低值，為0.40 mg/g，是對(duì)照組的92%。對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中與處理組趨勢(shì)接近，但含量始終高于處理組(圖8)。
圖8納米銀處理時(shí)間對(duì)糖含量的影響
3討論
納米銀能顯著抑制小麥赤霉病菌的生長(zhǎng)，50為0.59μg/mL。納米銀的抑制作用與其濃度成正比，隨著濃度的增大而增大。10μg/mL納米銀的抑菌率達(dá)到93.9%。Zhao等合成了一種新型的10-Hydroxycanthin-6-one抗菌劑，表明其對(duì)小麥赤霉病菌有很強(qiáng)的抑制活性，50μg/mL的10-Hydroxycanthin-6-one酯類衍生物7s(10-hydroxycanthin-6-one R=CH3CH3)化合物能完全抑制病原菌的生長(zhǎng)，10-meoxycanthin-6-one、10-Hydroxycanthin-6-one酯類衍生物7s(10-Hydroxycanthin-6-one R=CH3)和7t(10-Hydroxycanthin-6-one R=CH3CH2)化合物的最小抑菌濃度在3.91μg/mL到31.25μg/mL之間。陸云等研究了4種殺菌劑(氟環(huán)唑、己唑醇、甲基硫菌靈和南寧霉素毒立)對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)氟環(huán)唑和己唑醇對(duì)病原真菌的抑制效果最好，其50分別是0.201 5μg/mL和0.235 6μg/mL；其次是甲基硫菌靈，50是5.115 7μg/mL；南寧霉素毒力最弱，其50是389.313 24μg/mL。因此，納米銀較一些殺菌劑有相當(dāng)或更好的抑菌效果，有望成為一種新型納米殺菌劑。
納米銀處理小麥赤霉病菌2?10 h，菌體內(nèi)SOD、POD和CAT的活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在4 h達(dá)到最高值。結(jié)果表明，納米銀在抑菌過(guò)程中，影響了菌體內(nèi)3種酶的活性。原因可能是隨著脅迫程度的增強(qiáng)，氧自由基不斷積累，為了適應(yīng)環(huán)境，增強(qiáng)本身對(duì)脅迫的抵御能力，菌體的酶促系統(tǒng)中SOD、POD、CAT等活性也會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化，這是正常生理性抗逆反應(yīng)。然而菌體細(xì)胞在抵御過(guò)程中受到了破壞，所以酶的活性出現(xiàn)下降，細(xì)胞瀕臨死亡，從而造成菌體的生長(zhǎng)受到抑制。通過(guò)研究納米銀對(duì)3種保護(hù)酶活性的影響，得出破壞病原菌的膜保護(hù)系統(tǒng)是納米銀抑菌的機(jī)制之一。
有研究認(rèn)為，正常情況下細(xì)胞中SOD、POD和CAT 3種保護(hù)酶協(xié)調(diào)一致，可以防止過(guò)多自由基造成的細(xì)胞毒害，一旦細(xì)胞內(nèi)自由基所處動(dòng)態(tài)平衡被破壞，細(xì)胞就有可能受到損傷。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，SOD能夠嵌入到線粒體基質(zhì)中，防止細(xì)胞中產(chǎn)生過(guò)量的活性氧。CAT能夠防止體內(nèi)過(guò)多H2O2的產(chǎn)生，降低細(xì)胞發(fā)生氧化的可能性。POD能催化其他物質(zhì)的同時(shí)，將H2O2還原為H2O。SOD、POD和CAT作為生物體內(nèi)重要的抗氧化酶類，能夠降低對(duì)細(xì)胞膜起損傷作用的活性氧自由基，防止細(xì)胞受到破壞。由此可知，當(dāng)病原真菌受到納米銀的刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成能力超過(guò)其清除能力，導(dǎo)致3種保護(hù)酶的活性出現(xiàn)暫時(shí)升高的現(xiàn)象，但因活性氧自由基的不斷增多，導(dǎo)致細(xì)胞受到破壞，進(jìn)一步抑制菌體的生長(zhǎng)，使3種酶的活力開(kāi)始逐漸下降。高櫞等研究了月腺大戟根總黃酮對(duì)尖孢鐮刀菌3種酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)了同樣的變化趨勢(shì)。魏立強(qiáng)等研究了旱芹粗提物對(duì)棉花枯萎病菌保護(hù)酶活性的影響，結(jié)果表明，隨著納米銀處理時(shí)間的增加，菌體內(nèi)的SOD、POD和CAT活性同樣出現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。因此，病原真菌體內(nèi)3種保護(hù)酶系統(tǒng)的活性被破壞，損害活性氧自由基清除系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性嚴(yán)重?fù)p傷，從而使菌體受到一定程度的破壞。
小麥赤霉病菌經(jīng)納米銀處理后，病原菌的可溶性蛋白和糖含量降低，病原菌MDA含量和電導(dǎo)率出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。計(jì)紅芳等研究絨白乳菇發(fā)酵液提取物對(duì)楊樹(shù)葉枯病菌MDA含量的影響，發(fā)現(xiàn)同樣的變化趨勢(shì)。隨著納米銀處理時(shí)間的增加，小麥赤霉病菌細(xì)胞膜受到破壞，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)水解和變性，膜結(jié)構(gòu)的破壞，使得MDA不斷積累，從而出現(xiàn)升高趨勢(shì)，電導(dǎo)率由于電解質(zhì)外滲，同樣出現(xiàn)升高的現(xiàn)象。電導(dǎo)率升高，表明菌絲體浸出液壓力增加，可能是浸出液中存在滲漏的內(nèi)含物，而滲漏是由于菌絲細(xì)胞膜透性遭到了破壞。隨著菌體脂質(zhì)過(guò)氧化程度的加劇，細(xì)胞膜的完整性喪失，進(jìn)一步使得MDA和電導(dǎo)率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。納米銀可以顯著抑制病原菌的活性，說(shuō)明該物質(zhì)可以嚴(yán)重破壞病原菌的抗氧化系統(tǒng)，使得蛋白質(zhì)和糖類水解，進(jìn)而使細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷，細(xì)胞滲透性加強(qiáng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過(guò)研究納米銀對(duì)小麥赤霉病菌保護(hù)酶活性的影響，為納米銀抗真菌機(jī)理以及抑菌應(yīng)用提供理論依據(jù)，為防治植物真菌病害提供參考。為了進(jìn)一步了解納米銀對(duì)真菌的抑菌機(jī)理，仍需要進(jìn)行分子水平上的研究。
4結(jié)論
納米銀能顯著抑制小麥赤霉病菌的生長(zhǎng)，抑制作用隨著濃度的增加而不斷增大，10μg/mL的納米銀對(duì)病原菌的抑制率達(dá)90%以上，50為0.59μg/mL。
隨著納米銀處理時(shí)間的增長(zhǎng)，3種酶的活性均出現(xiàn)先增加后降低的變化。SOD、POD、CAT均在4 h出現(xiàn)最高值，10 h降至最低。納米銀提高菌體內(nèi)丙二醛含量，降低可溶性蛋白和可溶性糖含量。
納米銀的制備方法及對(duì)小麥赤霉病菌抗菌活性的影響（一）
納米銀的制備方法及對(duì)小麥赤霉病菌抗菌活性的影響（二）
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