柑桔砂皮病菌座殼菌生長(zhǎng)條件及納米藥劑篩選（一）
柑桔是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。近年,由子囊菌門(mén)真菌柑桔間座殼菌Diaporthecitri(無(wú)性態(tài)為柑桔擬莖點(diǎn)霉菌Phomopsiscitri,屬于半知菌類擬莖點(diǎn)霉屬)侵染引發(fā)的病害發(fā)展成為我國(guó)柑桔主要病害,因受害部位及癥狀不同,分別被稱為砂皮病(侵染葉片、小枝及幼果,患病組織表面常有紫褐色至黑褐色硬質(zhì)、略突出的膠點(diǎn),呈現(xiàn)為砂皮狀)、樹(shù)脂病(侵染枝干)、蒂腐病(侵染貯藏期果實(shí))。防控該病原菌的為害主要依靠化學(xué)防治,三唑類、多菌靈、甲基硫菌、吡唑醚菌酯等殺菌劑效果良好。目前我國(guó)農(nóng)藥劑型主要為乳油和可濕性粉劑等,載藥顆粒大,分散性能差,導(dǎo)致農(nóng)藥易流失,利用率不高。近年來(lái),納米材料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到應(yīng)用,納米試劑可以改善農(nóng)藥對(duì)靶標(biāo)的親和性,減少流失與分解,控制藥物釋放速率,延長(zhǎng)持效期,降低其在非靶標(biāo)區(qū)域和環(huán)境中的投放量與殘留污染,從而實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥的減量增效。
本試驗(yàn)從重慶市長(zhǎng)壽區(qū)“愛(ài)媛38”(現(xiàn)在普遍被稱為“紅美人”)雜柑園采集典型砂皮病葉,分離純化及鑒定病原菌,研究其生物學(xué)特性,篩選對(duì)其具抑制作用的納米藥劑,以期為防控該菌侵染為害提供參考。
1材料與方法
1.1材料
2021年4—5月從重慶市長(zhǎng)壽區(qū)“愛(ài)媛38”柑桔園采集砂皮病典型癥狀病葉。
培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA,馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA,馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA,胡蘿卜200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA,燕麥片30 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L)、Czapek培養(yǎng)基(硝酸鈉2 g,磷酸氫二鉀1 g,氯化鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,硫酸鎂0.5 g,蔗糖30 g,瓊脂20 g,水1 L)。
納米試劑包括土霉素碳量子點(diǎn)(OTC-CQDs)納米試劑(西南大學(xué)柑桔研究所提供)、SiO2納米試劑(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供)和星狀陽(yáng)離子聚合物(SPc)納米載體(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供)。
殺菌劑包括32%噻呋·氟環(huán)唑SC(山東省青島瀚生生物科技股份有限公司生產(chǎn))、430 g/L戊唑醇SC(拜耳股份公司生產(chǎn))和40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC(江西中迅農(nóng)化有限公司生產(chǎn))。
1.2方法
1.2.1病原菌分離與鑒定采用組織分離法,在病葉上取病健交界處組織3～4塊,消毒后放于PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)7 d,純化分離菌株,然后接種于PDA培養(yǎng)基上24℃培養(yǎng)7 d,觀察菌落培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子形態(tài)特征等。
采用科赫氏法則鑒定分離菌株的致病性。將分離菌株培養(yǎng)7 d后,接種菌餅在柑桔果實(shí)刺傷處,以接種無(wú)菌PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。使用無(wú)菌水浸濕脫脂棉保濕,28℃培養(yǎng)24 h后觀察癥狀。取接種果實(shí)發(fā)病處組織再次分離病菌,與接種菌進(jìn)行比較。
提取分離菌株DNA進(jìn)行分子鑒定。用滅菌的直徑5 mm的打孔器取菌餅,接種于PDA培養(yǎng)基上24℃恒溫保濕培養(yǎng)。當(dāng)菌落擴(kuò)展到培養(yǎng)皿的2/3時(shí),用滅菌的接種鏟輕輕地刮取菌絲,置于滅菌研缽中加入液氮充分研磨,至粉末狀。用滅菌藥匙將菌絲粉末轉(zhuǎn)移到滅菌的1.5 mL離心管中,采用真菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA,然后利用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系含有2×Taq PCR MasterMix 12μL,引物ITS1 1μL,引物ITS4 1μL,模板DNA 2μL,ddH2O 9μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min→(94℃變性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán))→72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度,然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察,檢測(cè)到單一清晰的條帶,純化后送測(cè)序公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序所得序列,在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì),然后基于GenBank中報(bào)道的其他病原菌的序列信息,利用最大似然法(Maximum Likehood,ML)通過(guò)MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
1.2.2病原菌生物學(xué)特性設(shè)置不同的碳源、氮源、光照、溫度及pH值等,觀測(cè)不同培養(yǎng)條件對(duì)分離菌株菌絲生長(zhǎng)的影響。
培養(yǎng)基的影響:將直徑5 mm的菌餅接種在PDA、PSA、CA和OA平板上,將接種好的平板倒置在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)3次,培養(yǎng)7 d后觀察培養(yǎng)性狀,用十字交叉法測(cè)菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。
碳源的影響:基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Czapek培養(yǎng)基,把Czapek培養(yǎng)基的蔗糖分別換為相同碳量的乳糖、甘油、麥芽糖、可溶性淀粉和甘露醇葡萄糖,以配制不同碳源的培養(yǎng)基,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復(fù)4次,25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)10 d后觀察培養(yǎng)性狀。
氮源的影響:基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Czapek培養(yǎng)基,把Czapek培養(yǎng)基的硝酸鈉分別換為相同氮量的尿素、蛋白胨、賴氨酸、甘氨酸和氯化銨,以配制不同氮源培養(yǎng)基,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復(fù)4次,25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)10 d后觀察培養(yǎng)性狀。
光照的影響:將直徑5 mm菌餅接種PDA平板上,置于25℃恒溫培養(yǎng),分別設(shè)置24 h全光照、12 h光暗交替和24 h全黑暗培養(yǎng)等光照條件,每處理組重復(fù)4次,培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)10 d后觀察培養(yǎng)性狀。
溫度的影響:將直徑5 mm菌餅接種到PDA上,分別置于15、20、25、30、35℃等溫度條件下進(jìn)行完全黑暗培養(yǎng),每處理重復(fù)4次,培養(yǎng)2 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)7 d后觀察培養(yǎng)性狀。
pH值的影響:PDA培養(yǎng)基滅菌后,在無(wú)菌條件下利用鹽酸和氫氧化鈉溶液將PDA培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為5、6、7、8和9,制成不同pH值的平板,接種直徑5 mm菌餅,每處理重復(fù)4次,25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,培養(yǎng)7 d后觀察培養(yǎng)性狀。
1.3不同試劑對(duì)病菌抑制作用測(cè)定
供試各納米試劑和抑菌劑各配成一定濃度溶液,分別與PDA混合制成含藥平板,使含藥平板中供試藥劑最終濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001μg/mL等5個(gè)濃度處理,以加入等量無(wú)菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照,每處理重復(fù)3次,接種直徑8 mm菌餅于平板中央,28℃恒溫培養(yǎng)7 d后,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,計(jì)算各處理菌絲生長(zhǎng)抑制率。抑制率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-8)]×100。使用GraphPad prism 8軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),將藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)(x),菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成抑制概率值(y),計(jì)算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)及抑制中濃度(EC50)。
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