臨床結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)：分子DST檢測VS表型DST藥敏診斷技術(shù)（一）
摘要:目的比較結(jié)核分枝桿菌表型藥敏與快速分子檢測結(jié)果的一致性。方法回顧性分析2017年1月至2020年12月浙江省嘉興市第一醫(yī)院確診的1750例涂陽肺結(jié)核患者痰液、肺泡灌洗液等標(biāo)本，同時進(jìn)行結(jié)核菌表型藥敏及快速分子檢測，對兩種檢測結(jié)果的一致性進(jìn)行比較，并對不一致的原因進(jìn)行分析。結(jié)果1750例患者按流程操作共檢測得到結(jié)核分枝桿菌菌株1596例（91.20%），其中1542例利福平（RFP）兩種方法檢測結(jié)果一致（敏感1478例，耐藥64例），一致率為96.62%;54例RFP不一致（3.38%）。1520例異煙肼（INH）兩種方法檢測結(jié)果一致（敏感1465例，耐藥55例），一致率為95.24%;76例INH不一致（4.76%）。利福平（RFP）ropB基因突變位點(diǎn)分子檢測檢出率為94.79%（91/96），表型藥敏檢出率為93.02%（80/86）。異煙肼（INH）katG、inhA基因突變位點(diǎn)分子檢測檢出率為95.79%（91/95），表型藥敏檢出率為87.91%（80/91）。分析兩種檢測結(jié)果不一致的原因有檢測標(biāo)本不一致、檢測技術(shù)局限性、不同突變類型、靜默突變、異質(zhì)性耐藥及其他耐藥機(jī)制。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌表型藥敏與分子檢測結(jié)果的一致性高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，臨床上擴(kuò)大分子藥敏作為初始診斷工具，可取得早診治、早防控的效果;當(dāng)檢測結(jié)果不一致時，應(yīng)及時分析原因，建議有條件的結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院使用兩種檢測方法平行檢測以提高精準(zhǔn)度。
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起的呼吸道傳染性疾病。耐多藥結(jié)核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）的流行是結(jié)核發(fā)病率居高不下的重要原因，也是世界性的公共衛(wèi)生問題。耐藥結(jié)核病的診斷主要依靠體外藥物敏感性試驗(yàn)（drug susceptibility testing，DST）。根據(jù)WHO指南，耐多藥/利福平耐藥結(jié)核?。╮ifampicin resistant tuberculosis，MDR/RR-TB）的發(fā)現(xiàn)首先需要細(xì)菌學(xué)確認(rèn)，進(jìn)一步行快速分子檢測、痰培養(yǎng)或基因測序檢測結(jié)核菌耐藥情況。因此，正確判讀快速分子檢測與表型藥敏檢測結(jié)果，選擇精準(zhǔn)方案及療程具有十分重要的意義。本研究收集2017年1月至2020年12月浙江省嘉興市第一醫(yī)院臨床診斷為結(jié)核病患者的痰液、肺泡灌洗液等標(biāo)本1750份，行快速分子檢測表型藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)報道如下。
1材料與方法
1.1病例及菌株來源
入選病例菌株均來自2017年1月至2020年12月浙江省嘉興市第一醫(yī)院結(jié)核門診及住院的涂陽肺結(jié)核患者痰液、肺泡灌洗液標(biāo)本，行快速分子檢測（Xpert MTB/RIF、基因芯片）及結(jié)核菌培養(yǎng)（羅氏固體培養(yǎng)及液體BACTEC MGIT960培養(yǎng)）并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，共計1750例。
1.2方法
1.2.1 Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)
痰樣本前處理。收集1～4 ml痰液樣本置于一次性的防漏容器中，在Xpert MTB/RIF檢測匣側(cè)壁標(biāo)記樣本序號（ID）。打開裝有痰液樣本的容器，加入痰液樣本2倍體積的樣本試劑（sample reagent，SR）。蓋上蓋子，劇烈搖動10～20次或渦旋震蕩至少10 s。將混合好的樣本在20～30℃孵育15 min。在孵育進(jìn)行到5～10 min時，再次劇烈搖動裝有痰液樣本的容器10～20次或渦旋震蕩至少10 s。視樣本性狀，將1～2倍體積的4%氫氧化鈉（NaOH）加入前處理管中，旋緊處理管的螺旋蓋，在渦旋振蕩器上振蕩1 min左右直至痰樣本充分液化，將前處理管置于生物安全柜內(nèi)，室溫靜置15 min;將45 ml磷酸緩沖鹽溶液（phosphoric acid buffer salt solution，PBS）加入液化好的痰液中，旋緊螺旋蓋，將前處理管在3000 r/min離心20 min;去上清，加入2 ml PBS。將樣品加入檢測匣后，打開檢測匣的蓋子，將處理后的樣品由檢測匣的加樣孔緩慢加入。見圖1。關(guān)閉檢測匣的蓋子，開始檢測，GeneXpert Dx軟件自動讀取信息進(jìn)行自動檢測。
1.2.2基因芯片檢測系統(tǒng)
采用DNA微陣列芯片法進(jìn)行菌種鑒定，使用博奧生物分枝桿菌菌種鑒定試劑盒，具體步驟如下。①從固體培養(yǎng)基上挑取菌落于含核酸提取液的核酸提取管中;液體培養(yǎng)基內(nèi)吸取≥1個麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?0～20μl于含核酸提取液的核酸提取管中;使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min，95℃水浴5 min，5000 r/mim離心1 min，得到的核酸放置-20℃暫存。②在標(biāo)本制備區(qū)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)、芯片雜交、芯片的洗滌與干燥等步驟，甩干后掃描。③使用晶芯微陣列芯片掃描儀LuxScan10K-B和相應(yīng)軟件進(jìn)行信號的讀取及結(jié)果判讀。陽性判斷值：對于IC（分枝桿菌屬）探針和結(jié)核分枝桿菌探針通過ROC方法確定其陽性判斷值。對于其他16種非結(jié)核分枝桿菌檢測探針均通過百分位數(shù)法確定其陽性判斷值。當(dāng)探針信號值大于或等于該探針的陽性判斷值，則該探針判讀為陽性;當(dāng)探針信號值小于該探針的陽性判斷值，則該探針判讀為陰性。試劑盒中各探針的陽性判斷值已整合到相應(yīng)判讀軟件中，由軟件自動對樣品檢測結(jié)果進(jìn)行判別。
1.2.3臨床結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)及體外藥敏試驗(yàn)
（1）結(jié)核分枝桿菌固體培養(yǎng)。①前處理方法：痰液中加2～4倍量2%NaOH，振蕩器振蕩5～10 min，或置室溫30 min、其間振蕩2～3次，使痰液化。取前處理液化后痰液0.1 ml，無菌操作接種于培養(yǎng)基斜面上，每份標(biāo)本同時接種兩支酸性改良羅氏培養(yǎng)基，置37℃孵育。對培養(yǎng)陽性的菌株進(jìn)行分枝桿菌菌群鑒定，在試劑瓶中加入對硝基苯甲酸（PNB）和噻吩二羧酸肼（TCH）試劑，觀察菌株生長指數(shù)，如繼續(xù)生長為非結(jié)核分枝桿菌，如生長受到抑制則為結(jié)核分枝桿菌。②藥物敏感性檢測：選擇4種常用的一線抗結(jié)核藥物（異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇）進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)，抗結(jié)核藥物濃度分別為異煙肼0.1 mg/L、利福平1.0 mg/L、鏈霉素1.0 mg/L、乙胺丁醇5.0 mg/L，采用WHO/國際防癆與肺部疾病聯(lián)合會《耐藥檢測指南》推薦的比例法。
（2）結(jié)核分枝桿菌960液體培養(yǎng)。①培養(yǎng)管準(zhǔn)備：MGIT營養(yǎng)添加劑（0.5%甘油，0.5%牛血清白蛋白，0.2%葡萄糖，140 mmol/L NaCl，OADC）為15 ml液體試劑，可直接使用，在每一根培養(yǎng)管中加入800μl MGIT營養(yǎng)添加劑備用。②樣本準(zhǔn)備：挑取1～2 ml膿性痰液部分至標(biāo)記的50 ml離心試管中;加等量的2%N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉-枸櫞酸鈉前處理液;漩渦震蕩20 s;靜置15 min;加無菌PBS（pH=6.8）至約50 ml，蓋緊蓋子;離心3000 r/min，15 min;倒掉上清液;添加1～3 ml PBS以中和pH值至6.8。③樣本接種：將上述預(yù)處理好的樣本接種500μl至MGIT培養(yǎng)管中。④MGIT培養(yǎng)管裝載至BACTECMGIT 960 System全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統(tǒng)孵育培養(yǎng)。
1.3統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)（或Mc Nem），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法一致性（Kappa>0.75，一致性較好;0.40～0.75，一致性一般;<0.40，一致性較差）。
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