轉(zhuǎn)錄水平解析昆蟲病原線蟲共生菌菌株新型殺菌蛋白PPIA-L20基因表達(dá)調(diào)控——?討論與結(jié)論
3討論與結(jié)論
本課題組前期從Xenorhabdus bovienii NN6菌株胞外蛋白中分離出一種抑菌蛋白PPIA-L20，為肽基脯氨酰異構(gòu)酶A類似物，該蛋白對鐮刀菌屬真菌具有極強的抑制效果。本研究發(fā)現(xiàn)ppia-l20基因表達(dá)水平不隨發(fā)酵時間變化而變化，與發(fā)酵時間沒有相關(guān)性，而胞外抗菌蛋白濃度隨發(fā)酵時間增加而增加。采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，基因ppia-l20在不同表達(dá)水平情況下，差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞膜相關(guān)功能、次級代謝產(chǎn)物合成、氨基酸合成、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)和鞭毛合成相關(guān)通路。這表明ppia-l20表達(dá)受到多種生物途徑的共同調(diào)節(jié)，在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)動態(tài)表達(dá)現(xiàn)象。
在本研究中，GO分析結(jié)果顯示差異基因主要歸屬于代謝過程、定位、膜等功能分類。KEGG富集通路預(yù)測結(jié)果與次級代謝產(chǎn)物合成、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)通路、鞭毛組裝與磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)通路相關(guān)。腸桿菌科中，陽離子抗菌肽能夠激活磷酸傳導(dǎo)系統(tǒng)中rcsB基因，激活信號傳遞給下游的ppia-l20，激活相關(guān)基因表達(dá)并輔助蛋白折疊進(jìn)行膜修飾等一系列應(yīng)激反應(yīng)以抵御抗菌肽的侵襲。本研究中，KEGG富集基因位于雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)通路中，磷酸傳導(dǎo)系統(tǒng)中rcsB基因激活，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)通路中的關(guān)鍵基因ompR顯著上調(diào)，kdpc、kdpB作為反應(yīng)調(diào)節(jié)因子顯著上調(diào)。在鼠傷寒桿菌中，磷酸傳導(dǎo)系統(tǒng)PhoPQ通過促進(jìn)PmrD蛋白的表達(dá)來控制PmrAB信號，PmrD蛋白與磷酸化的PmrA結(jié)合并阻止去磷酸化，導(dǎo)致PmrA調(diào)控基因的激活。PhoQ結(jié)構(gòu)與功能息息相關(guān)，PhoQ的陰離子結(jié)合位點朝向內(nèi)膜，其位置有利于與膜表面的陽離子AMPs相互作用。AMPs可能被位于內(nèi)膜(IM)內(nèi)部脂蛋白感知，從而導(dǎo)致rcsBCD激活，其機制尚不清楚。本研究中，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)基因和磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)rcsB基因的激活，可能與外部環(huán)境中的陽離子抗菌肽刺激相關(guān)。DEG富集通路包括雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)通路和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，細(xì)菌雙組分系統(tǒng)通過磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，通過傳感器激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)因子NlpE蛋白控制基因表達(dá)，幫助維持革蘭氏陰性細(xì)菌外膜(OM)完整性。這與GO分析中的細(xì)胞膜功能相關(guān)蛋白的表達(dá)相吻合。本研究結(jié)果表明，nlpE基因顯著下調(diào)，NlpE蛋白同時存在于PPIA-L20蛋白共同通路(陽離子抗菌肽抵抗通路)的上游，可能起到調(diào)控ppia-l20基因表達(dá)的作用。
鞭毛分泌系統(tǒng)的基因普遍下調(diào)，主要調(diào)控鞭毛調(diào)節(jié)器flhDC在運動協(xié)調(diào)中的作用，在嗜線蟲致病桿菌X.nematophilila中，反應(yīng)調(diào)節(jié)基因ompR或同源組氨酸激酶基因envZ失活后，抗生素產(chǎn)生和位于鞭毛基因簇附近的nrps1基因的表達(dá)水平均升高。ompR/envZ在抗菌物質(zhì)和毒力因子產(chǎn)生過程中起到負(fù)向調(diào)控的作用。已有研究證明，在嗜線蟲致病桿菌X.nematophilila中，細(xì)菌素復(fù)合體等外泌蛋白通過鞭毛Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)輸出，鞭毛轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子也可以通過調(diào)節(jié)毒力因子的表達(dá)來促進(jìn)毒力的發(fā)揮，鞭毛轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子fliZ能夠直接或間接上調(diào)編碼殺蟲毒素和抗菌化合物(XcnA-N、PaxABCT)的基因的表達(dá)。本研究中，fliZ基因顯著下調(diào)，與ompR/envZ基因顯著上調(diào)共同調(diào)控抗菌蛋白基因的表達(dá)結(jié)果一致。通過構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，與ppia-l20基因位于共同通路上的nlpE基因表達(dá)蛋白與雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)中cpxR基因表達(dá)蛋白具有互作關(guān)系，cpxR基因位于ppia-l20基因上游，與磷酸傳導(dǎo)系統(tǒng)中rcsB基因起到共同調(diào)控的作用。
綜上所述，ppia-l20基因表達(dá)可能受到陽離子抗菌肽抵制通路中的關(guān)鍵蛋白NlpE脂蛋白以及雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)和磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)。ppia-l20基因表達(dá)的抗真菌蛋白有巨大的開發(fā)價值，同時該基因在菌株受到外界抗生素刺激時也發(fā)揮重要作用。本研究首次對ppia-l20基因不同表達(dá)水平下的Xenorhabdus bovienii菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析了可能影響ppia-l20基因表達(dá)水平相關(guān)的通路，以及ppia-l20基因不同表達(dá)水平下相關(guān)差異表達(dá)基因的變化趨勢與其功能之間的關(guān)系，為進(jìn)一步探索基因表達(dá)調(diào)控機制提供參考，并為高效開發(fā)抗真菌生防制劑奠定理論基礎(chǔ)。
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