茯磚茶中金花菌菌落標準計數方法優化條件【試驗】（二）
2.1.2無菌稀釋液濃度對金花菌菌落總數的影響
無菌稀釋液濃度對金花菌菌落總數的影響見圖2。
圖2無菌稀釋液對金花菌菌落總數的影響
由圖2可知，磷酸緩沖溶液對金花菌孢子釋放作用不明顯，數量僅為（18.0±1.0）×105CFU/g。當稀釋液中NaCl濃度為0.85%時，金花菌菌落總數最多，為（35.0±0.8）×105CFU/g。當滲透壓過低時，過多的水分進入孢子，會使孢子膨脹或破裂而失活；當滲透壓過高時，孢子失水收縮，細胞結構容易被破壞而失活。因此，無菌稀釋液以0.85%NaCl溶液為宜。
2.1.3振搖時間對金花菌菌落總數的影響
振搖時間對金花菌菌落總數的影響見圖3。
圖3振搖時間對金花菌菌落總數的影響
金花菌菌落總數隨振搖時間的延長而增加，表明物理振搖對金花菌子囊果破壁也有一定影響。當振搖時間為50 min時，金花菌菌落總數為（36.9±0.8）×105CFU/g；振搖50 min后金花菌菌落總數趨于平緩，因此振搖時間選擇50 min。
2.2響應面結果與分析
2.2.1響應面試驗設計及結果
以篩子目數、無菌稀釋液濃度、振搖時間為自變量，以金花菌菌落總數為響應值，試驗設計與結果見表2。零點為區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。
表2響應面設計方案及試驗結果
2.2.2模型建立與回歸方程分析
采用Design-Expert.V8.0.6對試驗數據進行多元線性擬合，得到以金花菌菌落總數為響應值的二次多項回歸模型方程：Y=50.42-046A+0.54B+1.78C+0.65AB-0.075AC+2.63BC-8.94A2-10.88B2-14.41C2。對模型方程進行顯著性檢驗，方差分析結果見表3。
表3平板計數法回歸方程方差分析表
由表3可知，模型差異性極顯著（P＜0.000 1），說明方程與實際情況擬合較好，能夠反映金花菌菌落總數與各因素之間的關系；失擬項差異不顯著（P＞0.05），說明其他因素對試驗影響很小，適用于茯磚茶中金花菌菌落計數方法的優化。
表3中F值的大小可以判斷各因素對金花菌菌落總數影響的強弱。各個因素對金花菌菌落總數影響的程度大小的次序為篩子目數＞NaCl濃度＞振搖時間，數學模型的結果表明A、B、C、AB、BC、A2、B2及C2差異性達到極顯著水平（P＜0.01），表明各考察因素對金花菌菌落總數的影響具有交互作用，而不是簡單的線性關系。可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析和預測。其相關系數R2=0.997 9，表明試驗所選擇的3個變量對響應值的影響已達99.79%，表示該模型條件能夠很好地反映實際值。其他影響因素對菌落總數的影響可忽略不計。響應面試驗得到的最優處理條件為：篩子目數79.74目、NaCl濃度0.86%、振蕩時間50.49 min，模型預測的最佳菌落數為50.49×105CFU/g。
2.2.3各因素之間的響應面結果分析
各因素交互作用對金花菌菌落總數影響的響應面和等高線圖見圖4。
圖4各因素交互作用對金花菌菌落總數影響的響應面和等高線圖
響應面三維圖中曲面的陡峭程度可以表明自變量對金花菌菌落總數的影響程度，曲面較陡表明影響較大，反之則較小；而等高線圖反映了因素間交互作用的強弱大小，橢圓形表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著。結合本研究中的二次回歸方程及表3可知，二次項AB、BC具有極顯著的交互作用（P＜0.01），即篩子目數與NaCl濃度、NaCl濃度與振搖時間每兩個因素間均具有顯著的交互作用。由圖4可知篩子目數與NaCl濃度、NaCl濃度與振搖時間、篩子目數與振搖時間對菌落總數的影響先升高后降低，響應值呈拋物線形趨勢，因此回歸方程有極大值。
2.2.4模型的驗證試驗結果
為了檢驗響應面方法的可靠性，本研究按照模型得到的金花菌菌落總數最佳計數條件進行試驗操作驗證，結合試驗的可行性，得到最終優化條件為篩子目數80目、稀釋液為0.85%NaCl溶液、振搖時間50 min，平行6次試驗，得到金花菌菌落總數為（50.75±1.1）×105CFU/g，與模型預測的數值進行比較分析，菌落數的RSD值為1.1%，其RSD值遠遠小于3%，因此，可以選擇以上條件作為茯磚茶中金花菌菌落總數的最佳優化參數。
2.3方法驗證
采用上述優化方法與國標方法進行金花菌菌落總數的對比，結果見表4。
表4國標方法和優化方法對不同茯磚茶的計數結果
結果顯示，優化方法得到的金花菌菌落總數是國標方法的5倍左右。
3結論
目前關于金花菌菌落計數方法及破壁方法的研究較少，本研究在國標方法的基礎上對樣品前處理條件進行優化，取樣時將整塊茶磚撬碎混勻，茶樣粉碎過篩80目、稀釋液為0.85%NaCl溶液，振搖時間50min（轉速為200 r/min），該條件下，優化方法得到的金花菌菌落總數均在107CFU/g以上，相比國標方法提高了5倍左右，優化效果明顯，為確定金花菌標準計數方法提供了試驗依據。
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