維氏氣單胞菌分離與純化、一步生長(zhǎng)曲線、熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性研究（二）
2結(jié)果
2.1噬菌體分離與純化
從發(fā)病鯽魚(yú)腸道中獲得的分離液經(jīng)雙平板法后在平板上可見(jiàn)有大量噬菌斑產(chǎn)生，圖1A可見(jiàn)噬菌斑呈圓形，中間透明，邊緣清晰整齊，無(wú)暈環(huán)，但大小不一，分布不均勻，直徑在0.2～1.1 mm，噬菌斑的存在說(shuō)明腸道分離液中有宿主菌的噬菌體存在。噬菌體經(jīng)純化增殖后，梯度稀釋，用雙層平板法計(jì)數(shù)，該噬菌體的效價(jià)可達(dá)3.0×1012PFU/mL，噬菌體命名為SJTJYCA01。
圖1噬菌體的噬菌斑(A)和超微形態(tài)圖(B)
2.2噬菌體的超顯微形態(tài)
通過(guò)電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)分離的噬菌體為有尾噬菌體，屬于尾病毒目短尾噬菌體科，頭部直徑在45～60 nm，尾部長(zhǎng)在16～26 nm，見(jiàn)圖1B。
2.3最適感染復(fù)數(shù)
噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的MOI為0.1時(shí)的效價(jià)最高(效價(jià)值達(dá)2.55×109)，說(shuō)明噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)為0.1。見(jiàn)表1。
表1噬菌體SJTJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)
2.4一步生長(zhǎng)曲線
一步生長(zhǎng)曲線的結(jié)果見(jiàn)圖2，噬菌體SJTJYCA01的潛伏期為20 min，裂解期達(dá)40 min，裂解量為裂解期平均噬菌體數(shù)(14 458 PFU/mL)/潛伏期平均噬菌體數(shù)(255 PFU/mL)=57。
2.5熱穩(wěn)定性
在40℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率不隨時(shí)間的增加而減少；在60℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率大幅下降，作用20 min后存活率僅為原噬菌體的3%；在80℃條件下，各個(gè)時(shí)間段均未見(jiàn)有噬菌體存活。見(jiàn)圖3。
圖2噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線
圖3噬菌體SJTJYCA01的熱穩(wěn)定性
2.6 pH穩(wěn)定性
噬菌體SJTJYCA01對(duì)強(qiáng)酸強(qiáng)堿均較為敏感，在pH 5～10時(shí)較為穩(wěn)定；噬菌體SJTJYCA01的最適pH 7。見(jiàn)圖4。
圖4噬菌體SJTJYCA01的pH穩(wěn)定性
3討論
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)維氏氣單胞菌病例的報(bào)道逐年增多，其流行呈明顯上升趨勢(shì)，并已成為一種危害嚴(yán)重的人—獸—魚(yú)共患病原菌。噬菌體作為一種新興的生物抑菌劑日漸受到學(xué)者們的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于維氏氣單胞菌噬菌體的研究鮮有報(bào)道，僅可見(jiàn)Taruna等從池水中分離到維氏氣單胞菌的噬菌體VTCCBPA5和呂孫建等從中華鱉養(yǎng)殖塘中分離得到的非特異性寬譜噬菌體NTHP01(以嗜水氣單胞菌為宿主分離獲得)。
本試驗(yàn)以鯽魚(yú)源維氏氣單胞菌為宿主菌，從發(fā)病鯽魚(yú)的腸道中分離獲得噬菌體SJTJYCA01。該噬菌體在宿主菌上可形成圓形、透亮，具有典型烈性噬菌體特征的噬菌斑；參照《病毒分類——國(guó)際病毒分類委員會(huì)第九次報(bào)告》，對(duì)噬菌體SJTJYCA01的形態(tài)進(jìn)行觀察分析，結(jié)果可判定該噬菌體為尾病毒目短尾噬菌體科噬菌體(頭徑45～60 nm，尾長(zhǎng)16～26 nm)，此與Taruna等分離獲得的VTCCBPA5同屬于短尾噬菌體科(頭徑56 nm，尾長(zhǎng)5 nm)，卻有別于呂孫建等分離獲得的肌尾噬菌體科噬菌體NTHP01(頭徑60～145 nm，尾長(zhǎng)80～455 nm)。因此，這是鯽魚(yú)源維氏氣單胞菌短尾科烈性噬菌體在中國(guó)的首次報(bào)道。
感染復(fù)數(shù)是研究噬菌體與宿主之間量化與產(chǎn)出的重要生物學(xué)指標(biāo)，在不同感染復(fù)數(shù)條件下，噬菌體感染宿主菌后分裂得到的噬菌體子代的數(shù)量不同，因此，確定最適感染復(fù)數(shù)對(duì)于噬菌體進(jìn)一步的應(yīng)用研究具有重要作用。本試驗(yàn)獲得噬菌體SJTJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)為0.1，與王志麗分離的鱉源氣單胞菌噬菌體的最適感染復(fù)數(shù)相同，說(shuō)明該噬菌體裂解效率較高，少量的噬菌體侵染宿主菌即可產(chǎn)生噬菌體子代；噬菌體感染宿主菌的潛伏期和裂解期的長(zhǎng)短及裂解量的大小通常與噬菌體、宿主菌及生長(zhǎng)條件有關(guān)，從潛伏期可得知噬菌體吸附于細(xì)胞并釋放出子代噬菌體的最短時(shí)間，潛伏期和裂解量則是噬菌體增殖的2個(gè)特征性指標(biāo)。噬菌體SJTJYCA01潛伏期和裂解期分別為20 min、40 min，較噬菌體VTCCBPA5(潛伏期35 min)、泥鰍源氣單胞菌的噬菌體pAh1(潛伏期30 min)和鱉源氣單胞菌的噬菌體(潛伏期50 min)要短，遠(yuǎn)小于噬菌體NTHP01(潛伏期150 min)，且同樣對(duì)宿主菌具有較高的裂解量。
目前，氣單胞菌屬細(xì)菌(包括維氏氣單胞菌)能造成多種水生動(dòng)物發(fā)生運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥，該病在浙江、湖南、湖北、江西等地的發(fā)病高峰期為每年的6～9月(養(yǎng)殖水溫在20～30℃，pH一般呈弱堿或弱酸性)，常常出現(xiàn)急性暴發(fā)病，嚴(yán)重時(shí)的死亡率可達(dá)90%以上。本試驗(yàn)分離獲得的噬菌體SJTJYCA01在溫度低于40℃時(shí)能保持較好的穩(wěn)定性和活性，并在pH 7附近最為穩(wěn)定。因此，噬菌體SJTJYCA01能很好的適應(yīng)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，在水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病防控中應(yīng)用具有極大的可能性。本試驗(yàn)篩選獲得的維氏氣單胞菌烈性噬菌體，不僅豐富了水產(chǎn)致病菌噬菌體的菌種資源，并將為噬菌體作為生物抑菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
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