不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響——材料與方法
1、材料與方法
1.1材料與儀器
1.1.1菌種脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.2藥品和儀器乙酰輔酶A、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶均為Sigma產(chǎn)品，DNA酶、草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、ATP、ADP、NADP、NADH、NADPH均為進(jìn)口分裝生化試劑，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
UV765型紫外-可見分光光度計(jì)；ZHWY-2112型大振幅恒溫雙層搖床；高效液相色譜儀SPD-20A(MODEL)；雷磁pHS-3C pH計(jì)。
1.2培養(yǎng)基
1.2.1斜面培養(yǎng)基蔗糖30 g，蛋白胨10 g，玉米漿10 g，(NH4)2SO40.25 g，(NH4)2HPO41.5 g，MnSO4·H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.0～7.2。
1.2.2種子培養(yǎng)基蔗糖35 g，蛋白胨20 g，KH2PO45 g，(NH4)2SO42.0 g，(NH4)2HPO40.8 g，MgSO41.5 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.2 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.2～7.4。
1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖50 g，蛋白胨25 g，(NH4)2SO41 g，ZnSO4·7H2O 0.08 g，MgSO42 g，KH2PO40.8 g，甜菜堿10 g，5，6-二甲基苯并咪唑(DMBI)0.08 g，CoCl2·6H2O 0.15 g，CaCO32 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.2～7.4。
1.3搖瓶發(fā)酵方法
種子液的制備：每支培養(yǎng)好的脫氮假單胞桿菌新鮮斜面(18 mm×180 mm)加入10 mL無菌水，刮洗制備成菌懸液。以無菌吸管吸取2 mL菌懸液至裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶(裝量為50 mL/250 mL三角瓶)中，在搖床上進(jìn)行種子液的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度30℃；轉(zhuǎn)速180 r/min；培養(yǎng)至OD700為9～10(周期大概24 h)。
搖瓶發(fā)酵：培養(yǎng)好的種子液按10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶(裝量為40 mL/250 mL三角瓶)中，在30℃的溫度和180 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)。
將檸檬酸鈉按照相應(yīng)的濃度梯度(濃度梯度為0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。
1.4酶液的制備
取5 mL發(fā)酵液于4℃，4 000 r/min離心20 min，沉淀用5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)充分混勻后在上述相同條件下離心，棄上清繼續(xù)用PBS清洗再離心。上述處理后的沉淀中加入5 mL PBS，DNA酶(2.5 mg/mL)25μL，溶菌酶(25 mg/mL)300μL，充分混勻在30℃水浴振蕩30 min，于4℃8 000 r/min離心20 min，上清即為細(xì)胞裂解液。
1.5測(cè)定方法
1.5.1菌體生物量的測(cè)定
將取樣的發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯螅?00 nm處測(cè)定吸光值，用蒸餾水作為對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。菌體的光密度(OD700)=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。
1.5.2維生素B12含量的測(cè)定
取30 mL充分搖勻的發(fā)酵液于4 000 r/min離心10 min，去上清后加30 mL蒸餾水?dāng)噭蛟谏鲜鱿嗤瑮l件下離心，倒去上清液后加入10 mL蒸餾水將菌體攪勻，加入8%(質(zhì)量比)亞硝酸鈉溶液和冰乙酸各3 mL，搖勻，于95～100℃水浴30 min；水浴后冷卻至室溫，加蒸餾水定容至50 mL，過濾。所得濾液適當(dāng)稀釋后，在波長(zhǎng)為361 nm處進(jìn)行紫外光譜分析，根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出維生素B12含量，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。
1.5.3酶液中蛋白的測(cè)定酶液中蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。
1.5.4酶活的測(cè)定
(1)葡萄糖激酶：采用6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)比色法，1 mL反應(yīng)體積中含有50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，1 mmol/L ATP，0.5 mmol/L NADP，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L葡萄糖和0.7U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
(2)丙酮酸激酶：1 mL反應(yīng)體積中含有2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸，5 mmol/L ADP，2 mmol/L果糖-1，6-二磷酸，0.15 mmol/L NADH，80 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2和2.85 U L-乳酸脫氫酶。
(3)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶：1 mL反應(yīng)體積中含有2 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，1 mmol/L NADP和10 mmol/L MgCl2。
(4)磷酸果糖激酶：采用酶偶聯(lián)法，1 mL反應(yīng)體積中含有2 mmol/L果糖-6-磷酸，1 mmol/L ATP，0.3 mmol/L NADH，10 mmol/L MgCl2，1 U醛縮酶，3.5 U磷酸丙糖異構(gòu)酶和1 U甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
(5)檸檬酸合成酶：1 mL反應(yīng)體積中含有1 mmol/L 2-硝基苯甲酸(DTNB)，0.5 mmol/L乙酰輔酶A，10 mmol/L草酰乙酸和10 mmol/L MgCl2。
葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活測(cè)定時(shí)，1 mL反應(yīng)體系和50μL細(xì)胞裂解液分別在30℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，混合后立即連續(xù)測(cè)定340 nm處吸光值10 min，△A值=反應(yīng)10 minA340值-反應(yīng)0 minA340值，根據(jù)所繪制的NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線算出酶量。
丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的酶活測(cè)定時(shí)，1 mL反應(yīng)體系和50μL細(xì)胞裂解液分別在30℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，混合后立即連續(xù)測(cè)定340 nm處吸光值10 min，△A值=反應(yīng)0 minA340值-反應(yīng)10 minA340值，根據(jù)所繪制的NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線算出酶量。
檸檬酸合成酶的酶活測(cè)定時(shí)，1 mL反應(yīng)體系和50μL細(xì)胞裂解液分別在30℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，混合后立即連續(xù)測(cè)定412 nm處吸光值10 min，△A值=反應(yīng)10 minA340值-反應(yīng)0 minA340值，根據(jù)公式A=εbc算出酶量，摩爾吸光系數(shù)ε=1 485 L/(mol·cm)。
一個(gè)酶活力單位(U)定義為在30℃下，1分鐘催化1μmol的底物反應(yīng)所需的酶量。根據(jù)各樣品的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出酶的比活力(比活力代表的是添加檸檬酸鈉與不添加檸檬酸鈉對(duì)照酶活下的比值)。
1.5.5有機(jī)酸的測(cè)定采用HPLC法，色譜條件：色譜柱Hi-Plex H(8μm，300 mm×7.8 mm)，流動(dòng)相0.01 M H2SO4，流速0.4 mL/min，樣品量10μL，溫度50℃，檢測(cè)器UV 210 nm。標(biāo)準(zhǔn)品為檸檬酸、延胡索酸、乙酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸和丙酸。
不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響——摘要、結(jié)論與討論
不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響——材料與方法
不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響——結(jié)果與分析
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