Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨及聯合暴露對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的毒性作用（三）
2.4細菌ROS活性檢測
過量ROS會造成細菌氧化損傷，甚至使細菌活性受到影響。重金屬氧化損傷所產生的ROS可攻擊膜脂，導致膜功能障礙，同時對蛋白質、DNA和細胞內系統造成損害。圖4為暴露于Zn2+和Cd2+后細菌體內的ROS產生量變化。單一金屬對細菌毒性影響的結果表明：Zn2+濃度從2μg?mL-1增加到20μg?mL-1，E.coli和B.subtilisti產生的ROS變化顯著（P<0.05）。Zn在酶催化反應、細胞代謝、信號傳遞等生理調節過程中發揮重要作用，有助于抑制自由基和ROS的產生，從而可增強蛋白質的穩定性和抗氧化酶的活性。然而過量的Zn會起到毒性作用，Zn會與其他金屬發生錯金屬化阻斷蛋白質硫醇表達，從而引發基本生物功能的破壞，導致細胞毒性。Cd2+濃度從2μg?mL-1增加到10μg?mL-1，E.coli和B.subtilisti產生的ROS變化顯著（P<0.05），雖然Cd2+濃度低，但其毒性很高。Cd2+濃度的增加會誘導細菌產生過量的ROS，造成DNA損傷，最后使生物體發生細胞凋亡。此外，細胞內ROS產生量的增加可能與金屬引起的抗氧化劑消耗（如谷胱甘肽）有關。直接影響重金屬對生物體毒性效應的不是吸附金屬離子的數量，而是能夠與酶、蛋白質、DNA以及其他細胞結構的功能基團反應的離子或分子的數量。
圖4 Zn2+和Cd2+對兩種細菌ROS產生量的影響
細菌處于Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白聯合暴露的條件下時，隨著濃度增加兩種菌體ROS的產生量整體呈現先上升后降低趨勢（圖5），各處理組細菌ROS產生量都低于對照組（除了濃度為2μg?mL-1的Zn2+-Cry1Ac復合體對E.coli的ROS產生量為103.1%）。如圖5所示，聯合暴露下E.coli和B.subtilis的ROS產生量呈顯著性變化（P<0.05），這與單獨金屬離子暴露下細菌ROS產生量呈現的趨勢不同，是與金屬離子與色氨酸的吲哚基團之間的N配位有關。在Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac體系中，Zn2+和Cd2+對吲哚基團（色氨酸）中的N具有很強的結合能力，導致其對細菌的氧化損傷降低，從而進一步降低金屬毒性。Zn2+-Cry1Ac處理比Cd2+-Cry1Ac處理下E.coli體內ROS產生量多：一方面，Cd2+會誘導細菌防御機制響應誘導谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）和金屬硫蛋白（MT）等幾種保護酶的升高，這些酶能夠拮抗Cd的毒性，更多的抗氧化酶能夠清除生物體中Cd脅迫產生的超氧陰離子和過氧化氫等。另一方面，用純Cd2+溶液（如CdCl2）進行培養時，其對細菌的毒性大于Zn2+溶液。Cd2+-Cry1Ac較Zn2+-Cry1A對細菌的毒性低，這是因為Cd2+與其他物質（例如各種離子或有機成分）之間的相互作用通常會改變Cd2+的毒性，此時Zn2+-Cry1A聯合暴露對細菌毒性更強。
圖5 Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白聯合暴露對兩種細菌ROS產生量的影響
2.5發光細菌急性毒性檢驗
發光細菌的發光抑制率反映重金屬對細菌的毒性效應。有研究發現Zn濃度大于1.2 mg?L-1時對發光細菌的發光強度有明顯抑制作用，Cd和Pb濃度改變對發光強度的影響不顯著。如圖6所示，不同濃度Zn2+、Cd2+均對Vibrio fischeri產生抑制，且抑制率隨金屬濃度增加而變大（P<0.05）。Zn2+濃度從2μg?mL-1增加到20μg?mL-1，Zn2+對Vibrio fischeri的發光抑制率由41%增加到85%；Cd2+濃度從2μg?mL-1增加到10μg?mL-1，Cd2+對Vibrio fischeri的發光抑制率由39%增加到61%；即不同濃度金屬離子的毒性效果不同，濃度愈高，毒性愈強。相同濃度下Zn2+對Vibrio fischeri的抑制率大于Cd2+，即Zn2+對Vibrio fischeri的毒性較大。青海弧菌Q67和費氏弧菌的毒性實驗結果也表明Zn2+的毒性大于Cd2+，可能是Zn2+與硫的親和力強于Cd2+，導致其對發光細菌毒性較大。
圖6不同濃度Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白及復合體系對費氏弧菌生長抑制率的影響曲線
從圖6（c）中可以看出，各處理對細菌作用15 min后，隨著Cry1Ac蛋白濃度升高，Vibrio fischeri的發光抑制率由負到正，這是由于Cry1Ac蛋白本身含有具有內源熒光特性的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），其中最主要的是色氨酸。具有熒光特性的Cry1Ac蛋白與Vibrio fischeri結合導致熒光強度增強，因此抑制率為負，隨著Cry1Ac蛋白濃度的增加，抑制率逐漸增大，但不會對細菌造成毒性影響。研究發現，轉基因Bt稻草（Cry1Ab蛋白）在淹水條件下分解的Cry1Ab蛋白對細菌不會造成毒害作用，即Bt蛋白不會對土壤微生物構成危害。
Zn2+、Cd2+與Cry1Ac聯合暴露下Vibrio fischeri的生長抑制率也由負到正，這是由于發出熒光的Cry1Ac蛋白和Zn2+、Cd2+結合使自身熒光強度有所減弱。研究表明，具有熒光特性的Cry1Ac蛋白與不發光的金屬離子相互作用，降低了Vibrio fischeri產生的熒光強度，這與本實驗的結果一致。仇愛鋒等的研究表明隨著Cd2+和Cu2+對費氏弧菌暴露時間的延長，菌體細胞膜通透性增強，毒性增大。本研究中，隨著濃度的升高各處理對Vibrio fischeri的抑制效果增強，相同濃度下各處理對Vibrio fischeri的抑制效果表現為Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。
3、結論
（1）高濃度的Zn2+、Cd2+會對E.coli、B.subtilis生長產生抑制作用，細菌存活率也顯著降低（P<0.05），兩種細菌相比B.subtilis的耐受性強于E.coli。
（2）Cry1Ac蛋白不會對細菌造成毒性損傷；二元體系聯合暴露時Zn2+、Cd2+均與Cry1Ac蛋白（吲哚基團）結合，使得Zn2+、Cd2+對兩種細菌的毒性降低。
（3）兩種細菌活性氧產生量表明Zn2+和Cd2+對E.coli和B.subtilis造成了嚴重損傷，Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac聯合暴露對E.coli和B.subtilis沒有造成嚴重損傷。
（4）Zn2+、Cd2+及Cry1Ac蛋白濃度增加對Vibrio fischeri的發光強度抑制增強，相同濃度下各處理體系的發光抑制效果為Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。