不同濃度巴西蘇木素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長及抑制作用（二）
1.2.2蘇木抑菌試驗
1.2.2.1蘇木萃取液、巴西蘇木素和原蘇木素B溶液制備
稱量蘇木100 g放于離心管中與無水乙醇200 mL以1∶2的比例混勻，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中震蕩48 h然后離心，4 500 r/min離心5 min，取離心管稱量并標(biāo)記序號，取上清液于離心管中，開蓋放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中50℃震蕩24～96 h以揮發(fā)盡無水乙醇，稱取萃取后蘇木質(zhì)量，加適量DMSO配成1 000 mg/mL的萃取液原液，再取原液倍比稀釋成500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.90 mg/mL共8個質(zhì)量濃度。將巴西蘇木素單體和原蘇木素B單體分別用DMSO配制成64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL共11個質(zhì)量濃度。
1.2.2.2菌液制備
將所有CRABA接種于血平板，37℃培養(yǎng)18 h，挑取數(shù)個分離純化后的菌落置于生理鹽水試管中,比濁儀校正濃度至0.5麥氏單位(1.5×108cfu/mL)。
1.2.2.3蘇木萃取液對10株CRABA的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)測定
于無菌96孔板中每孔加入肉湯菌液100μL，第1個孔加入1 000 mg/mL蘇木萃取液100μL，采用微量倍比稀釋法，使蘇木萃取液質(zhì)量終濃度分別為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81和3.90 mg/mL共8個濃度，每孔加入菌液20μL。將96孔板放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。
1.2.2.4巴西蘇木素對10株CRABA的MIC、MBC測定
于無菌96孔板中每孔加入肉湯100μL，而后加入11個濃度分別為64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的巴西蘇木素溶液100μL，每孔加入菌液20μL，取菌液200μL作為陽性對照，肉湯培養(yǎng)基200μL作為陰性對照。將96孔板放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。
1.2.2.5原蘇木素B對10株CRABA的MIC測定
于無菌96孔板中每孔加入肉湯100μL，而后加入11個濃度分別為64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的原蘇木素B溶液100μL，每孔加入菌液20μL，取菌液200μL作為陽性對照，肉湯培養(yǎng)基200μL作為陰性對照。將96孔板放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。
1.2.3高效液相檢測蘇木組分
1.2.3.1樣品提取
稱取蘇木各5 g置于錐形瓶中，加入乙醇100 mL，用封口膜把瓶口封好。超聲提取30 min，用0.22μm有機膜濾膜過濾到樣品瓶中。
1.2.3.2標(biāo)準品溶液的制備
分別精密稱取蘇木提取液、巴西蘇木素、DMSO，置于3個滅菌EP管中。
1.2.3.3高效液相色譜法檢測
采用C18(5μm，4.6 mm×250.0 mm)色譜柱，流速為1.0 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫35℃，進樣量5μL。流動相為乙腈∶水，梯度洗脫條件見表1。
表1梯度洗脫條件
1.2.4CRABA的生長曲線測定
取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的CRABA，用無菌生理鹽水配制成0.5麥氏濁度，取100μL菌液分別加至巴西蘇木素濃度不同的100μL肉湯培養(yǎng)基中，使肉湯中巴西蘇木素的濃度為1/8 MIC(0.063 0 mg/mL)、1/2 MIC(0.250 0 mg/mL)、1 MIC(0.500 0 mg/mL)。每隔4 h進行取樣，用酶標(biāo)儀檢測600 nm處的吸光度值，繪制生長曲線。
1.2.5十二烷基磺酸鈉(sodium 1-dodecanesulfonate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)
取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的CRABA，配制成0.5麥氏濁度，取3 mL菌液分別加至巴西蘇木素濃度不同的3 mL肉湯培養(yǎng)基中，使巴西蘇木素的濃度為1/8 MIC(0.063 0 mg/mL)、1/2 MIC(0.250 0 mg/mL)、1 MIC(0.500 0 mg/mL)。置于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，于16 h取樣4 mL，3 155×g離心10 min，去除上清液，收集菌體；加入4 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)并萃取，洗滌1次(3 155×g離心10 min)，再加入2 mL PBS，取等體積(1 mL)的各標(biāo)本加入EP管，5 560×g離心5 min(23℃)收集菌體，重懸于160μL PBS并加40μL蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min轉(zhuǎn)速300 r/min后13 350×g離心10 min，取上清液備用。選用12%分離膠，5%濃縮膠，上樣20μL進行SDS-PAGE。經(jīng)考馬斯亮藍染色1 h后脫色，顯示蛋白譜帶。
1.2.6巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合抑菌試驗
配制0.500 0、0.250 0、0.063 0、0.031 0 mg/mL的巴西蘇木素和0.256 0、0.128 0、0.064 0、0.032 0、0.016 0 mg/mL的美羅培南，將不同濃度的巴西蘇木素和美羅培南交叉配制為200μL肉湯后加入96孔板，并將板置于Biosense全自動微生物生長曲線分析系統(tǒng)上。配制不同濃度的巴西蘇木素+美羅培南肉湯各200μL加入96孔板，加入配制試驗菌液20μL，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。記錄MIC甲藥單用和MIC乙藥單用，并觀察兩藥聯(lián)用的MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙藥聯(lián)用，相加值最小數(shù)值為最佳組合，計算部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)。FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，>0.5～1.0為相加作用，>1.0～2.0為無關(guān)作用，>2.0為拮抗作用。
不同濃度巴西蘇木素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長及抑制作用（一）
不同濃度巴西蘇木素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長及抑制作用（二）
不同濃度巴西蘇木素對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌生長及抑制作用（三）
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