鼠疫耶爾森氏菌在3種選擇培養基生長能力的測定——材料與方法
在鼠疫疫源地監測中，當動物鼠疫處于流行末期或靜息期，由于鼠疫菌毒力減弱或完全喪失，不能致動物死亡，但存在于動物體內，由于菌量減少，若按一般常規培養基分離鼠疫菌比較困難，因此進行培養時必須要求特別敏感的增菌培養基分離鼠疫菌，而且自然界鼠疫菌一般從自斃動物體內分離，由于自斃動物腐敗，從一個污染的材料中分離鼠疫耶爾森菌(鼠疫菌)，受變形桿菌、革蘭氏陽性菌的影響鼠疫菌分離困難[1]。因此研制及應用一種分離鼠疫耶爾森氏菌的選擇培養基，可以提高鼠疫菌的分離率，是野外鼠疫監測現場及實驗室研究的關鍵技術。現有鼠疫菌的選擇培養基主要有龍膽紫培養基，在實際工作中，這2種培養基分離污染材料中的鼠疫菌效果不理想，本研究根據鼠疫菌培養特性，在基礎培養基中加入可以刺激鼠疫菌生長的生化試劑和抑制變形桿菌及革蘭氏陽性菌的試劑，研制出2種選擇敏感培養基(1%枸椽酸鈉選擇培養基和4%十二烷基硫酸鈉選擇培養基)，通過實驗菌株在以上2種培養基的生長測試，并收集野外材料現場分離，比較2種選擇敏感培養基對于鼠疫菌的檢出性能和檢測效果，初步評價其應用效果。
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1腐敗材料搜集野外動物材料(旱獺，犬)共5份，其中1號和4號旱獺僅剩股骨殘骸，2號、3號旱獺及5號犬臟器高度腐敗，但仍保留心、肝、脾、肺，各臟器均有不同程度潰爛。
1.1.2實驗菌株
耶爾森氏菌屬的鼠疫疫苗株(EV菌株)、假結核耶爾森菌、小腸結腸炎耶爾森菌以及野外腐敗材料常見雜菌:變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌均由鼠疫菌專業實驗室提供。
1.1.3儀器設備
丹麥Biosense微生物全自動菌落計數器，英國Symbioses公司;低氧細胞工作站H45 HEPA，英國DWS公司;Ⅱ級B2型生物安全柜，賀利氏HERAsafe生物，德國Heraus公司，中國細菌濁度標準管(批號2018-1)由中國藥品生物制品檢定所提供。
1.2方法
1.2.1基礎培養基的制備
赫氏瓊脂，含牛肉消化液200 m L，水800 m L，蛋白胨10 g，瓊脂14 g，乳糖10 g，調p H7.2～p H7.4。對照培養基:1%溶血赫氏培養基，將基礎培養基121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃左右，冷卻后加入10%脫纖維兔溶血，混勻后傾注平皿。
1.2.2龍膽紫培養基
龍膽紫0.1 g加無水乙醇2 m L溶解后，加蒸餾水至90 m L，121℃高壓滅菌30 min高壓滅菌后冷卻至50℃加入新鮮血液10 m L，混合后取10 m L加入基礎培養基1 L，制備成含有1/10萬龍膽紫溶血瓊脂培養基。
1.2.3 1號培養基
(4%十二烷基硫酸鈉選擇培養基)十二烷基硫酸鈉4 g，紅霉素0.5 mg，膽鹽3號5 g，阿莫西林12.5 mg，甘露醇1 g，中性紅0.03 g)。2號培養基(1%枸櫞酸鈉選擇培養基)去氧膽酸鈉1 g，枸櫞酸鈉1 g，枸櫞酸鐵1 g。將以上2種選擇培養基試劑分別經121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃的1000 m L基礎培養基中，即組成不同的選擇培養基，4℃保存備用。
1.2.4鼠疫耶爾森氏菌在3種選擇培養基生長能力的測定
將鼠疫EV菌株28℃培養48 h，制成濃度為1000個菌/m L菌懸液，取0.1 m L分別接種以上3種選擇培養基和對照培養基，置于28℃溫箱培養24～48 h，實驗重復3次，觀察記錄平板單個菌落生長情況。
1.2.5 3種培養基敏感性及特異性檢測
將各實驗菌株(耶爾森氏菌屬的鼠疫EV菌株、假結核耶爾森菌、小腸結腸炎耶爾森菌)、野外腐敗材料常見雜菌(變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌)制成菌懸液，根據比濁管稀釋成1000個菌/m L菌懸液，取0.1 m L涂布到4種培養基上，實驗重復3次，28℃孵箱培養24～48 h，觀察細菌生長情況。
1.2.6腐敗動物材料
鼠疫菌分離培養采集腐敗動物臟器材料(旱獺和犬的股骨、肝、脾)，分別接種3種選擇培養基，28℃孵箱培養24～48 h，觀察鼠疫菌生長及分離情況。在各選擇培養基上挑選可疑鼠疫菌菌落經鼠疫噬菌體實驗確診為鼠疫菌，以上實驗均以1%溶血赫氏培養基為對照培養基。
1.2.7菌落計數參考《GB 4789.2—2016，菌落總數測定》。