銅綠假單胞菌適配體的篩選和裁剪【研究進(jìn)展】
銅綠假單胞菌是一種專性需氧的革蘭氏陰性菌，是引起人類機(jī)會(huì)性感染的最主要的微生物，對(duì)人類造成多種健康威脅。因此，快速、靈敏、特異的檢測(cè)對(duì)預(yù)防及治療銅綠假單胞菌感染十分關(guān)鍵。目前常規(guī)的檢測(cè)方法仍存在耗時(shí)久、成本高、操作難度大等問(wèn)題，因此需要更加高效經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。適配體是一種從隨機(jī)文庫(kù)中篩選出來(lái)的寡核苷酸，能夠形成多種復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，近年來(lái)，由于其易于合成和修飾，并且具有高親和力和強(qiáng)特異性而受到了廣泛的關(guān)注，也涌現(xiàn)出了大量基于適配體的銅綠假單胞菌檢測(cè)和防治的研究。
適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）得到的具有特異性識(shí)別能力的人工合成寡核苷酸序列，1990年首次通過(guò)體外篩選被開(kāi)發(fā)[8]。適配體一般為幾十個(gè)堿基構(gòu)成的DNA或者RNA序列，目前已經(jīng)有超過(guò)千項(xiàng)的適配體篩選研究被報(bào)道[9]。適配體的可識(shí)別靶標(biāo)十分豐富，包括重金屬、細(xì)胞、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)[10]。由于其具有高親和力、高特異性且易于合成和修飾等特點(diǎn)，得到了廣泛的研究。
本文總結(jié)了目前銅綠假單胞菌適配體的篩選和裁剪方面的研究進(jìn)展。
銅綠假單胞菌的篩選和裁剪
高性能適配體的獲得是實(shí)現(xiàn)多領(lǐng)域應(yīng)用的基礎(chǔ)，為了獲得更好的適配體，往往需要進(jìn)行篩選和裁剪。在適配體的篩選中，首先對(duì)寡核苷酸文庫(kù)進(jìn)行制備，并將含有隨機(jī)寡核苷酸數(shù)量超過(guò)1014以上的RNA或者DNA文庫(kù)與靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行孵育，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的反應(yīng)后，將可以與靶標(biāo)結(jié)合的核酸序列與未結(jié)合的核酸序列進(jìn)行分離，對(duì)于可結(jié)合靶標(biāo)的核酸，通過(guò)PCR等方式對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，以生成新的寡核苷酸庫(kù)。重復(fù)以上步驟5-15次后對(duì)富集文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)多種技術(shù)對(duì)測(cè)序得到的序列進(jìn)行親和力和特異性分析，最終從數(shù)量龐大的文庫(kù)中得到具有優(yōu)越性能的適配體序列用于下一步的傳感器開(kāi)發(fā)（圖1）[11?-13]。盡管通過(guò)幾輪甚至十幾輪的篩選，可以從中獲得較好的核酸序列，但是由于隨機(jī)文庫(kù)篩選中固有的局限性，即使隨機(jī)文庫(kù)中已經(jīng)具有相當(dāng)多數(shù)量的核酸序列，篩選獲得適配體序列依然可能存在部分堿基在特異性的識(shí)別中不能發(fā)揮積極的作用，因此通過(guò)裁剪對(duì)這些冗余的堿基進(jìn)行去除或?qū)τ行A基進(jìn)行重復(fù)有助于獲得性能更優(yōu)的適配體。目前，針對(duì)銅綠假單胞菌已有多種適配體得到了開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，除了以微生物適配體篩選中常見(jiàn)的全細(xì)胞作為篩選靶標(biāo)外，銅綠假單胞菌的外毒素A和脂多糖也被用作靶標(biāo)進(jìn)行相關(guān)適配體的篩選（表1），多種銅綠假單胞菌靶標(biāo)適配體的篩選為其檢測(cè)提供了更加廣泛的可能性。此外，在已經(jīng)篩選的銅綠假單胞菌適配體中，既包括DNA適配體，也包括RNA適配體。
圖1 SELEX流程圖
表1銅綠假單胞菌適配體的篩選
全菌是微生物適配體篩選中最常見(jiàn)的靶標(biāo)，利用菌體較大的特點(diǎn)，通過(guò)離心操作可以有效的分離結(jié)合序列和未結(jié)合序列，在銅綠假單胞菌的適配體篩選中，既包括了以死菌為靶標(biāo)的適配體篩選，也包括了以活菌作為靶標(biāo)的篩選。2011年，Wang等[14]首次對(duì)銅綠假單胞菌的適配體進(jìn)行了篩選，經(jīng)過(guò)15輪的篩選，文庫(kù)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的結(jié)合能力不再繼續(xù)增加，因此結(jié)束篩選進(jìn)行核酸測(cè)序，經(jīng)過(guò)測(cè)序得到了親和力為（17.27±5.00）nmol/L的適配體序列。2017年，Soundy等[15]首次針對(duì)活的銅綠假單胞菌開(kāi)展了適配體的篩選。經(jīng)過(guò)7輪的全細(xì)胞篩選，對(duì)熒光標(biāo)記的適配體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，第7輪文庫(kù)與靶標(biāo)的結(jié)合效果與初始文庫(kù)相比有了顯著的增強(qiáng)，經(jīng)過(guò)測(cè)序得到了適配體序列JN08和JN27，經(jīng)過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，JN27中單個(gè)莖環(huán)為唯一顯著的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。因此對(duì)該莖環(huán)部分單獨(dú)進(jìn)行序列合成，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行結(jié)合效果的評(píng)估，結(jié)果驗(yàn)證具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的適配體序列具有較好的結(jié)合效果，是篩選得到的長(zhǎng)適配體序列的核心結(jié)合區(qū)域。
除了對(duì)全菌進(jìn)行篩選，銅綠假單胞菌的毒力因子也已經(jīng)作為靶標(biāo)物質(zhì)開(kāi)展了適配體的篩選。外毒素A是銅綠假單胞菌重要的毒力因子，也是其感染的重要標(biāo)志物。Hong等[16]利用誘餌SELEX（Decoy-SELEX）對(duì)外毒素A的適配體進(jìn)行篩選。在篩選中牛血清白蛋白和霍亂毒素作為負(fù)篩靶標(biāo)使用，經(jīng)過(guò)14輪的篩選對(duì)測(cè)序得到的適配體序列，利用表面等離子共振進(jìn)行親和力的檢測(cè)，得到Kd值為4.2-4.5μmol/L。此外，Ye等[17]基于Capture-SELEX技術(shù)篩選得到了適用于包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的多種菌脂多糖檢測(cè)的適配體，其長(zhǎng)度為80 nt，由于較長(zhǎng)的核酸序列難以從石墨烯表面進(jìn)行釋放，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行裁剪，并利用等溫量熱滴定法對(duì)其親和力進(jìn)行評(píng)估，最終確定了27 nt的最佳適配體，該適配體可以對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌的脂多糖進(jìn)行識(shí)別和結(jié)合，并且在裁剪中親和力從（102±17）nmol/L上升至（46.2±9.5）nmol/L。
除了這些DNA適配體，銅綠假單胞菌的RNA適配體也得到了開(kāi)發(fā)。與DNA適配體相比，RNA適配體盡管穩(wěn)定性稍差但在內(nèi)化至細(xì)胞方面更具優(yōu)勢(shì)。利用氟修飾的RNA文庫(kù)，Davydova等[18]篩選得到了可以內(nèi)化到細(xì)菌細(xì)胞中的適配體，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，該適配體與銅綠假單胞菌rRNA片段相同，進(jìn)一步佐證了該適配體可以內(nèi)化至細(xì)菌細(xì)胞的可能性。
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