朱鹮細胞系的建立、體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定（一）
朱鹮(Nipponia nippon)屬鸛形目(Ciconiiformes)鹮科(Threskiornithidae)朱鹮屬(Nipponia),是世界級珍稀瀕危物種,國家I級重點保護鳥類。朱鹮曾經廣泛分布于日本、朝鮮半島、中國和俄羅斯西伯利亞西南部。然而,20世紀中葉以來,由于環境污染、全球氣候變暖、捕獵和人類活動等因素的影響,朱鹮的數量急劇減少,野生種群在日本、朝鮮半島和俄羅斯的分布地區先后消失。中國自從1964年在甘肅康縣采集到一只標本后,直到1981年的近20年一直沒有朱鹮的報道（Ding,2004)。1981年野生朱鹮種群(7只)在陜西洋縣被重新發現（Liu,1981)。此后,我國在朱鹮的保護和研究方面開展了大量的工作,主要包括朱鹮生態生物學、保護生物學、遺傳學、解剖學、飼養繁殖、病理學、疾病防治以及保護管理和再引入等。由于國家的高度重視,野生朱鹮及其棲息地得到了有效保護,野生種群數量不斷增加。同時,朱鹮人工飼養繁殖也與野生種群的保護同步進行。1989年,北京動物園人工繁殖朱鹮在世界上首次獲得成功(Li,1989)。隨后三個朱鹮人工種群分別在北京和陜西建立,有力保證了朱鹮種群的恢復和發展。大量的研究工作也為朱鹮的科學保護奠定了堅實的基礎（Ding,2004)。
野生動物的遺傳資源保護,除建立專門的保護機構、制定相關法律和建立國家公園、自然保護區及易地保護外,以深低溫(-196°C)凍存動物的生殖細胞和體細胞則為另一條有效的途徑(Shi,1989)。細胞是生命的基本單位,具有生命所有的遺傳信息。動物體細胞系的建立,為從細胞和分子水平開展各類研究提供經濟、方便的材料來源,也為以后再建當時或許已滅絕的物種提供材料儲備。迄今為止,還沒有關于朱鹮體細胞成功建系的報道。對我國的朱鹮,Liu et al（1992)報道了兩只飼養于北京動物園的朱鹮的染色體性別鑒定及核型分析的結果,但未見朱鹮染色體G帶、C帶和Ag帶的報道。
本研究利用微創取樣方法,在不對朱鹮造成致命傷害的前提下,獲得其皮膚樣本,成功建立了朱鹮的體細胞系,并對該細胞系的體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定以及染色體G帶、C帶和Ag帶等進行了分析。
1材料和方法
1.1材料來源
雌、雄兩只成年朱鹮均來自陜西朱鹮人工繁殖中心。取材前徹底消毒背部皮膚,用眼科剪剪下～0.5 cm×1 cm的一塊皮膚,迅速放入運輸培養基內。動物行傷口縫合處理后放回飼養網。
1.2細胞培養
細胞培養用運輸液為含有100 U/mL青霉素鈉以及100μg/mL鏈霉素的DMEM(GIBCO);生長液為含有10%胎牛血清的OPTI-MEM(GIBCO),pH 7.2～7.4;培養器皿為培養面積25 cm2的一次性塑料培養瓶(Corning)。
1.2.1原代細胞培養
使用含兩倍雙抗的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌皮膚組織塊5次,剪小至～1 mm;加入0.25%胰酶(1:250,Amresco)0.5 mL消化0.5 min后迅速加入生長液抑制胰酶作用;PBS清洗一次后,將組織塊貼至培養瓶瓶壁,1 h后加入1 mL生長液,37°C培養24 h后補加培養液至5 mL;此后每3天換液一次。待15 d后可見細胞開始從組織塊長出,再培養5 d后即可傳代。
1.2.2細胞傳代
待組織塊周圍細胞均長成致密的單層后即可進行細胞傳代。棄去生長液,PBS清洗一次后加入0.25%胰蛋白酶1 mL,37°C消化1～2 min后加入5 mL新鮮生長液;輕拍瓶壁分散細胞,補加生長液至15 mL后吸出一半至另外一個培養瓶(1:2傳代);37°C,5%CO2條件下培養,待長成單層后,再按上述方法傳代。
1.2.3細胞凍存
用0.25%胰酶消化、收集對數生長期細胞,離心后棄去上清液;加入新鮮配制的凍存液[小牛血清90%,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,Amresco)10%]制備成2×106個/mL的細胞懸液,每個凍存管分裝1 mL;凍存管置于程序凍存盒(Nalgen)內,-80°C過夜后,移入液氮內長期保存。
1.2.4細胞復蘇
從液氮中取出凍存管后迅速放入37°C水浴中,讓細胞在1～2 min內完全融化;在無菌環境下將細胞接種到培養瓶內,37°C,5%CO2條件下培養。3 d后細胞即可長成單層。
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