豬鏈球菌對34種常用藥物的敏感性檢測【藥敏實(shí)驗(yàn)】
摘要：豬鏈球菌是一種常見的病原菌，能引起動物和人類發(fā)生豬鏈球菌病，本實(shí)驗(yàn)通過在山西靈石某豬場發(fā)病豬群中取樣，分離病原菌，并且對病原菌進(jìn)行培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定以及PCR的技術(shù)擴(kuò)增其gdh和16srRNA的序列，然后進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。鑒定出分離菌能夠在鮮血平板上形成溶血環(huán)、革蘭氏染色陽性、43種生化試驗(yàn)結(jié)果以及擴(kuò)增出特異性條帶，表明分離到的病原菌為豬鏈球菌。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見其對強(qiáng)力霉素等藥物敏感，而對頭孢曲松和磷霉素完全耐藥。為山西地區(qū)豬鏈球菌的防治提供參考。
豬鏈球菌可引起豬的敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀。它是世界范圍內(nèi)引發(fā)豬鏈球菌病最主要的病原，目前已確定有35（1～34及1/2）個(gè)血清型，不同國家和地區(qū)具有不同的流行株，其中2型流行最廣、致病性最強(qiáng)。
豬鏈球菌不斷的在各地發(fā)生，其對藥物的敏感程度也在不斷的發(fā)生變化，特別是對一些常用藥的敏感性降低，甚至出現(xiàn)耐藥菌，趙慧梅等對山西地區(qū)豬鏈球菌分離株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)可見大多對鏈霉素和慶大霉素耐藥。湖南分離到的豬鏈球菌對四環(huán)素和磺胺甲惡唑耐藥率達(dá)到100%。
本研究對山西地區(qū)分離到的豬鏈球菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，通過對34種常用藥物的敏感性檢測，旨在為山西省篩選藥物防治豬鏈球菌病提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1病料來源疑似豬鏈球菌感染的組織器官采集于山西靈石縣某豬場。
1.1.2主要試劑血瓊脂平板培養(yǎng)基購于鄭州安圖綠科生物工程有限公司。TSA和TSB培養(yǎng)基購于美國BD公司。新生牛血清購于杭州四季青生物公司。核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物Trans2K plus DNA Marker購自北京東盛生物有限公司。細(xì)菌全基因組快速提取試劑盒購自北京捷瑞生物有限公司。鏈球菌參考血清購自丹麥皇家血清研究所（Statens Seruminstitut，Copenhagen，Denmar k），引物是由上海生工有限公司合成。測序由上海生工有限公司完成。生化鑒定由山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院山西大醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。
1.1.3藥敏紙片藥敏紙片購于北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司，共34種，藥物如下：青霉素、氨芐西林、鏈霉素、慶大霉素、硫酸新霉素、卡那霉素、紅霉素、阿奇霉素、頭孢噻吩、頭孢拉定、頭孢唑啉、氧氟沙星、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、鹽酸林可霉素、鹽酸恩諾沙星、阿米卡星、磷霉素、磺胺嘧啶鈉、頭孢哌酮、頭孢呋辛鈉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、苯唑西林、乙酰螺旋霉素、磺胺氯吡嗪鈉、硫酸粘桿菌素、鹽酸沙拉沙星、硫酸安普霉素、鹽酸林可霉素、鹽酸土霉素。
1.2方法
1.2.1病原的分離培養(yǎng)無菌收集發(fā)病豬的關(guān)節(jié)液，肝臟，心臟，脾臟等器官，將采集的病料劃線接種于添加有5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基，37℃24 h后挑取針尖大小、灰白色、呈圓形、表面光滑、邊緣整齊的菌落純培養(yǎng)接種于鮮血瓊脂平板。
1.2.2鏡檢對可見溶血環(huán)的疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)晶紫1 min，碘液1 min，酒精脫色30 s，復(fù)紅50 s，油鏡下鏡檢觀察。
1.2.3生化鑒定挑取TSA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種于TSB中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后的菌液送檢。
1.2.4細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增對病原菌使用細(xì)菌全基因組快速提取試劑盒，鏡檢呈陽性，生化鑒定為鏈球菌，提取全基因組。具體步驟為：挑取TSA復(fù)蘇的單菌落，在含5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)約10 h，取2 mL菌液4 000 rpm離心5 min以收集菌液，將菌沉淀重懸，加10μL 10 mg/mL溶菌酶溶液，充分混勻后于37℃靜置30 min以上，以破除細(xì)胞壁。破壁后加入混有SDS的15 mg/mL蛋白酶K 30μL，于55℃水浴2 h，加等量酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），8 000 rpm離心10 min。此時(shí)吸取上層清液于另一EP管中，于其中加異丙醇使DNA完全沉淀，8 000 rpm離心5 min取沉淀。使用冷乙醇洗滌沉淀，同上步離心棄上清液，向沉淀中加DNA洗脫液靜置充分溶解DNA，4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〕鰜淼幕蚪M為模板，對分離菌的gdh基因和16SrRNA序列擴(kuò)增的方法進(jìn)行分子鑒定，使用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增。
1.2.5藥敏實(shí)驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法，挑取豬鏈球菌單個(gè)菌落密集均勻地涂布整個(gè)平板，將含有抗生素藥物的濾紙片用燒灼滅菌的鑷子分別貼于平板表面，相互間應(yīng)間隔一定距離，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。
2結(jié)果
2.1病原分離培養(yǎng)結(jié)果
從發(fā)病豬內(nèi)臟器官和關(guān)節(jié)等部位分離到的病原菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落周圍有透明溶血環(huán)。
2.2病原菌鏡檢結(jié)果
病原菌革蘭氏染色鏡檢為G+，染成紫色的球菌呈單個(gè)、兩個(gè)相連或連接呈現(xiàn)短鏈狀（見圖1）。
2.3生化鑒定結(jié)果
經(jīng)43種生化試驗(yàn)，分離菌株符合豬鏈球菌的生化培養(yǎng)特性，鑒定為豬鏈球菌（見表2）。
2.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果
擴(kuò)增豬鏈球菌的gdh基因后得到566 bp的條帶。16srRNA基因擴(kuò)增可見有1411 bp的條帶。
2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果
用34種藥物對分離到的豬鏈球菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。
由表可見，豬鏈球菌分離株對強(qiáng)力霉素、卡那霉素等藥物敏感，而對頭孢曲松和磷霉素完全耐藥。
3討論
豬鏈球菌的鑒定一般采用培養(yǎng)特性及生化實(shí)驗(yàn)，溶血實(shí)驗(yàn)等，也有用PCR的方法擴(kuò)增其gdh基因和16srRNA基因序列的并將其擴(kuò)增測序以及同源性比對。還有人通過擴(kuò)增其cps和epf基因來鑒定豬鏈球菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合傳統(tǒng)生長生化實(shí)驗(yàn)，溶血實(shí)驗(yàn)與PCR擴(kuò)增其gdh基因和16srRNA基因的方法來鑒定豬鏈球菌尚屬國內(nèi)首例。
由于藥物的不合理使用，導(dǎo)致豬鏈球菌耐藥株的出現(xiàn)，各地均出現(xiàn)了不同藥物的耐藥株，常見藥物對豬鏈球菌2型的敏感性呈現(xiàn)下降趨勢，耐藥普擴(kuò)大。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果卻是對生產(chǎn)中較為常用的強(qiáng)力霉素、卡那霉素、紅霉素及環(huán)丙沙星等藥物均敏感，而對頭孢曲松和磷霉素出現(xiàn)耐藥性。這可能與養(yǎng)殖場管理人員的思維定勢有關(guān)，認(rèn)為常用抗生素使用過頻，耐藥性肯定會嚴(yán)重，轉(zhuǎn)而使用生產(chǎn)中不常用的頭孢曲松和磷霉素，造成鏈球菌對這兩種藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致防治不力。因此在生產(chǎn)用藥中應(yīng)該做到輪換用藥和聯(lián)合用藥，降低病原菌產(chǎn)生耐藥性的速度。
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