撒壩豬耳緣組織成纖維細(xì)胞系生長曲線、生物污染檢測結(jié)果——材料與方法
摘要：實(shí)驗(yàn)采用撒壩豬耳緣組織塊貼壁培養(yǎng)法首次對(duì)撒壩豬成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍保存建立了撒壩豬耳緣成纖維細(xì)胞系；并對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活率、細(xì)胞核型等生物學(xué)特性進(jìn)行分析；還利用透射電鏡觀察了耳緣組織細(xì)胞。結(jié)果表明：細(xì)胞倍增時(shí)間為48 h，生長曲線為“S”型；染色體中正常二倍體染色體(2n=38)所占比例為92.56%；細(xì)菌、真菌、病毒和支原體等微生物污染檢測均顯示為陰性。透射電鏡觀察顯示，成纖維細(xì)胞呈長梭型。
隨著全球生物多樣性及其遺傳資源喪失程度的加劇，使得各國紛紛投入大量人力和財(cái)力，并以多種方式收集、保存和整理大自然賦予人類的寶貴財(cái)富，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Culture，ECACC)都相繼保存了大量生物資源的培養(yǎng)物。
云南地方物種豐富，撒壩豬是云南省優(yōu)良的地方豬種，耐粗飼、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)好(味好鮮嫩)，為農(nóng)民增收做出了極大的貢獻(xiàn)，是較好的地方品種。作為我省的特色品種，為了更好地保護(hù)和利用撒壩豬遺傳資源，非常有必要開展撒壩豬種質(zhì)資源保存研究。與傳統(tǒng)的活體保存相比，體細(xì)胞保存具有占用場地小、投資少、不受群體和個(gè)體生理利用年限制約、可以長期保存種質(zhì)資源等優(yōu)勢。為加強(qiáng)撒壩豬這一獨(dú)特地方品種保護(hù)，本試驗(yàn)以撒壩豬耳緣組織為材料，體外培養(yǎng)和建立了成纖維細(xì)胞系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)材料：撒壩豬來源于楚雄州種豬場，試驗(yàn)用組織塊來源于2月齡撒壩豬耳緣組織。
1.1.2主要試劑、儀器：胎牛血清(FBS)、高糖DMEM由Gibco公司生產(chǎn)。胰蛋白酶和青鏈霉素溶液購自Bioind公司；一次性塑料培養(yǎng)皿為Nunclon公司生產(chǎn)。
主要儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、倒置相差顯微鏡(Olympus，Nikon)、透射電鏡(JEM-1011)、實(shí)體顯微(Olympus)、微生物立體計(jì)數(shù)儀等。
1.2方法
1.2.1耳緣組織成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)
撒壩豬耳緣組織剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。取耳緣組織樣本0.6 cm×0.6 cm，75%酒精浸泡2 min，然后用生理鹽水+1%青鏈霉素溶液洗3次，放入高糖DMEM+1%青鏈霉素中，放入4℃泡沫箱，確保24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。超凈臺(tái)上剪刀刮去皮膚表面污物。PBS清洗4次后，用手術(shù)剪和鑷子剪成碎塊，放入直徑為50 mm培養(yǎng)皿中，每皿8塊左右進(jìn)行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為：高糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素。最后放入培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2，飽和濕度)中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察、照相，記錄細(xì)胞遷移和增殖情況。
1.2.2成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶(皿)底壁80%左右時(shí)，PBS清洗3次，加入0.125%胰酶(含0.01%EDTA)37℃消化5 min后，倒置相差顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞開始變圓時(shí)，加細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，吹打細(xì)胞使其完全脫落，以1∶2或1∶3的比例進(jìn)行傳代。倒置相差顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞生長增殖狀況，并拍照。傳代培養(yǎng)液與原代培養(yǎng)液相同。
1.2.3成纖維細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇
胰酶消化收集細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清，用凍存液調(diào)整細(xì)胞濃度為1～3×107/mL左右，充分混勻，分裝于凍存管中。標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存管編號(hào)、性別和凍存日期。-80℃冰箱過夜，次日投人液氮罐中長期保存。細(xì)胞凍存液為高糖DMEM+30%FBS+10%二甲基亞砜(DMSO)。
細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)將凍存管從液氮中取出，迅速投人42℃水浴鍋中1 min，不停搖動(dòng)使其受熱均勻。轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。移至培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察復(fù)蘇細(xì)胞生長狀況，并拍照。
1.2.4耳緣組織透射電鏡觀察
撒壩豬耳緣組織剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。用消毒好的耳號(hào)鉗取材后，用鋒利的手術(shù)剪立即剪小并放入裝有3.5%戊二醛的離心管中固定，放入4℃泡沫箱，送昆明醫(yī)學(xué)院電鏡中心進(jìn)行透射電鏡分析。
1.2.5成纖維細(xì)胞生長曲線測定
取傳至第2代的撒壩豬成纖維細(xì)胞，胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，接種于24孔培養(yǎng)板。從第2天開始到細(xì)胞長滿，每天隨機(jī)取3孔，連續(xù)7 d記數(shù)。用血球計(jì)數(shù)板在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)，取其平均值，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
1.2.6撒壩豬成纖維細(xì)胞的核型檢測
取培養(yǎng)至匯合度為85%左右，并處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞為試驗(yàn)材料，參照Sun Y L方法進(jìn)行染色體制備。
1.2.7細(xì)胞活率測定及微生物檢測
對(duì)凍存前后的第2、4、6代細(xì)胞進(jìn)行PI染色，統(tǒng)計(jì)計(jì)算細(xì)胞存活率。微生物檢測參見Doyle，Hay RI和Guan等。
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