撒壩豬耳緣組織成纖維細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線、生物污染檢測(cè)結(jié)果——結(jié)果與分析、討論
2結(jié)果與分析
2.1撒壩豬成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
組織塊培養(yǎng)5 d左右，成纖維細(xì)胞和少量類上皮細(xì)胞從組織塊周圍移出生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，大量成纖維細(xì)胞從組織塊周圍遷出并迅速增殖，成纖維細(xì)胞呈典型的長(zhǎng)梭形。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶(皿)底壁80%左右時(shí)，進(jìn)行消化并傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后，生長(zhǎng)加快，3～4 d細(xì)胞即可長(zhǎng)滿瓶底而再次傳代。原代細(xì)胞及傳代后細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果見圖1。
圖1撒壩豬成纖維細(xì)胞A：原代細(xì)胞(20 X)B：第5代細(xì)胞(20X)
2.2撒壩豬耳緣成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞活率
撒壩豬耳緣組織成纖維細(xì)胞凍存前活率為94.16%，復(fù)蘇后活率為91.12%，細(xì)胞在凍存前和復(fù)蘇后都有較高的存活率，達(dá)到90%以上，表明細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)健康狀況良好，培養(yǎng)條件適宜。另外，凍存對(duì)其存活率影響不大。
2.3撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析
撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析結(jié)果如圖2所示：細(xì)胞與細(xì)胞之間排列疏松，無緊密連接和橋粒，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細(xì)胞器，胞核呈長(zhǎng)梭形，常染色質(zhì)較為豐富。圖2A黃色箭頭所示為表皮層和真皮層的皮膚類細(xì)胞，為橢圓形。圖2A、2B紅色箭頭所示為位于基底層的成纖維細(xì)胞，為長(zhǎng)梭型。
圖2撒壩豬耳緣組織透射電鏡分析(黃色箭頭所示皮膚類細(xì)胞，紅色箭頭所示為成纖維細(xì)胞)
2.4撒壩豬成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)觀察
每天計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值，繪制撒壩豬成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型(圖3)，細(xì)胞有約3d的緩慢生長(zhǎng)期。此后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，第7天細(xì)胞數(shù)達(dá)最大。然后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平頂期，此時(shí)由于細(xì)胞密度增大，細(xì)胞生長(zhǎng)受接觸抑制的影響，細(xì)胞開始衰老凋亡。
圖3撒壩豬成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
2.5撒壩豬成纖維細(xì)胞核型分析
參照Levan[7]等的標(biāo)準(zhǔn)，第3代細(xì)胞核型取100個(gè)分裂相進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，撒壩豬染色體中正常二倍體染色體(2n=38)所占比例為92.56%。說明所培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳性能穩(wěn)定，該細(xì)胞系為穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞系。
圖4撒壩豬核型圖(母)(1000x)
2.6撒壩豬成纖維細(xì)胞系微生物污染檢測(cè)結(jié)果
2.6.1細(xì)菌、真菌污染檢測(cè)結(jié)果
接種細(xì)胞的液體培養(yǎng)基和陰性對(duì)照一樣，沒有混濁，而陽性對(duì)照表現(xiàn)有明顯微生物生長(zhǎng)。
2.6.2病毒檢測(cè)結(jié)果
紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。日常相差顯微鏡觀察，未見有病毒造成的細(xì)胞損傷現(xiàn)象。
2.6.3支原體檢測(cè)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)采用Hoechst 33342 DNA熒光染色法，未檢查到撒壩豬成纖維細(xì)胞被支原體污染。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，僅細(xì)胞核顯色，細(xì)胞表面及細(xì)胞周圍干凈、清晰，無熒光小點(diǎn)。如圖5 A所示。陽性對(duì)照組經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，可見細(xì)胞核與細(xì)胞膜及其周圍均可見散在的藍(lán)色熒光顆粒所圖5 B所示。證明我實(shí)驗(yàn)室建立的撒壩豬成纖維細(xì)胞系支原體檢測(cè)呈陰性。
圖5撒壩豬成纖維細(xì)胞支原體檢測(cè)
3討論
據(jù)張利娟等報(bào)道，豬的染色體數(shù)目為2n=38。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明撒壩豬的染色體數(shù)目為2n=38，與上述結(jié)論一致。撒壩豬成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)中，隨著傳代次數(shù)的增加，生長(zhǎng)速度會(huì)變慢。此外，細(xì)胞的二倍體染色體數(shù)目正常的比例呈逐步下降的趨勢(shì)，細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性有所改變。可能是由于細(xì)胞本身端粒酶長(zhǎng)度的縮短或者體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞的DNA造成的損傷。而本實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)的細(xì)胞始終維持二倍體生物學(xué)性狀，保持與體內(nèi)細(xì)胞相似性較大，因此不能傳代太多，傳2～3代細(xì)胞不用于實(shí)驗(yàn)就立即低溫凍存。對(duì)原代細(xì)胞以及復(fù)蘇后細(xì)胞中染色體眾數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，2n=38的占90%以上，染色體沒有異常表現(xiàn)，說明該細(xì)胞系為穩(wěn)定二倍體細(xì)胞系。
核型制備過程中，固定和滴片是核型分散成功的保證，適當(dāng)?shù)牡纹叨纫彩侨旧w分散良好的重要條件。撒壩豬成纖維細(xì)胞核型制備時(shí)，用0.25μg/mL終濃度的秋水仙胺處理細(xì)胞2.5 h，低滲40 min，1.5 m滴片，能夠得到分散度好、數(shù)量多的細(xì)胞中期染色體。撒壩豬染色體長(zhǎng)度的測(cè)定計(jì)算中，實(shí)驗(yàn)對(duì)多個(gè)中期染色體分裂相進(jìn)行了觀察、分析、比對(duì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，撒壩豬的染色體2n=38，與其它豬的染色體相似。
本研究從撒壩豬耳緣組織中分離、培養(yǎng)并建立了成纖維細(xì)胞系。通過形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果看，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，絕大多數(shù)是成纖維細(xì)胞，其中含有少量其他類型的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞。由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶耐受性不同。因此，利用此差別，通過幾次傳代后，就可得到純化的成纖維細(xì)胞。
低溫保存技術(shù)是生物科學(xué)的一門分支學(xué)科，是指將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定冷凍速率(或不同溫度梯度應(yīng)用不同的冷凍速率，并且有一定的保持時(shí)間)降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫)，此溫度能夠維持生物樣本活性暫停，進(jìn)而可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞保存過程中，需要盡可能降低細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而保持解凍后細(xì)胞活性、黏附能力及代謝活性。本試驗(yàn)采用10%DMSO加培養(yǎng)液來凍存細(xì)胞，凍存前細(xì)胞活率為94.16%，復(fù)蘇后的細(xì)胞活率91.12%，細(xì)胞復(fù)蘇后10～15 h可見細(xì)胞貼壁；復(fù)蘇后第2天更換培養(yǎng)液，2～3 d長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶。說明凍存的各項(xiàng)條件對(duì)細(xì)胞損傷不大，撒壩豬成纖維細(xì)胞可在液氮凍存，解凍后細(xì)胞可繼續(xù)傳代培養(yǎng)，活率與凍存前相比相差不大。可以用該法保存撒壩豬這種優(yōu)良的動(dòng)物遺傳資源。
綜上所述，本研究建立的撒壩豬耳緣組織成纖維細(xì)胞系增殖快，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定。該細(xì)胞系的建立，使撒壩豬這一國(guó)家重要遺傳資源在細(xì)胞水平上得以保存下來，并為相關(guān)遺傳學(xué)研究提供了有效的理論依據(jù)和理想的生物材料。同時(shí)對(duì)于開展其他動(dòng)物成纖維細(xì)胞系的建立也有一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)意義。
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