巨大芽孢桿菌BM24生長曲線、耐藥性、益生潛力評估及藥敏試驗（一）
摘要
本試驗旨在評估一株從健康細毛羊糞便中分離得到的巨大芽孢桿菌BM24的體外益生潛力及體內安全性。采集飼養過程中沒有添加抗生素的健康新疆細毛羊的新鮮糞便，先通過形態學鑒定、生化鑒定、16S rRNA測序，初步獲得羊源芽孢桿菌菌株，后續通過對酸和高濃度膽鹽環境的耐受性，以及菌株的體外抗菌能力、耐藥性、溶血活性和生長曲線等方面的檢測，初步判斷分離出的芽孢桿菌菌株的體外安全性，最后進行小鼠體內試驗，評估其安全性。結果表明:1)初步分離得到1株羊源芽孢桿菌，結合生化鑒定和測序結果確定為巨大芽孢桿菌，將其命名為巨大芽孢桿菌BM24;2)該菌株可在pH=1.0條件下存活，0.3%膽鹽培養4 h后存活率為49%，在15種常見抗生素中對12種抗生素高度敏感，對常見腹瀉致病菌沙門氏菌和大腸桿菌抑制效果較好，無溶血活性;3)該菌株在37℃培養2 h后進入生長對數期，6 h后進入生長平穩期;4)灌胃該菌株后小鼠無死亡、體重變化正常，剖檢體腔臟器無眼觀病理現象，對肝臟、腎臟、脾臟指數及血細胞指標均無顯著影響(P>0.05);腹腔注射該菌株，小鼠體征正常、無死亡現象，體腔臟器無眼觀病理變化。綜上可知，本試驗分離得到的羊源巨大芽孢桿菌BM24具有良好的體外益生潛力，且無急性毒性作用，可作為羊源益生菌的候選菌株。
近年來，由于養殖業中抗生素的過度使用，導致耐藥菌株增多、藥物殘留、污染環境、甚至危害人體健康等問題頻發，2020年7月，我國開始全面禁止使用促進生長的抗生素作為飼料添加劑，因此開發綠色健康的飼料添加劑是大勢所趨，已有研究證明益生菌可作為常規抗生素飼料添加劑的替代品，發揮調節動物的腸道微生態平衡、增強動物免疫功能、促進消化與吸收、提高動物的生產性能等有益作用。
芽孢桿菌是一類能夠在逆境下形成內生孢子以抵制不良環境的飼用益生菌，正是因為芽孢桿菌能夠產生內生孢子的這一特性，使得其相較于其余幾種常用益生菌更具優勢，目前畜禽業飼料添加劑中廣泛應用的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌等。巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)作為芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽性桿菌，常見于土壤、植物表面和水底沉淀物中，具有解磷固氮、消除異味、凈化水體、改善養殖環境、提高機體免疫力、改善動物生長性能等作用。Yao等研究發現，巨大芽孢桿菌可改善哺乳犢牛的生長性能，提高免疫功能及腸道氧化狀態;貢笑笑等研究發現，土壤來源的巨大芽孢桿菌1259制劑能夠促進山羊瘤胃細菌豐度以及腸道中有益微生物的增殖，提高荷斯坦奶牛標準乳產量;飼料中添加60 mg/kg巨大芽孢桿菌1259可顯著增加56日齡揚州鵝體重，縮短出欄時間，提高經濟效益。
研究顯示，微生物的益生特性與宿主種屬特異性有關，同一宿主來源的微生物更易于在該宿主腸道定植并表達其生物活性，并可改善宿主的生長性能與腸道健康。目前，國內外尚未見羊源益生性巨大芽孢桿菌的相關報道。因此，本研究擬從成年健康新疆細毛羊糞便分離出具有拮抗病原菌、對抗生素敏感的潛在益生性芽孢桿菌，并評估其耐受性、溶血活性、體內安全性，目的是為羊源益生性芽孢桿菌的開發提供參考，也為羊用微生態制劑在新疆養羊業中的應用提供理論支持。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1糞便樣品和試驗動物
糞便樣品來源于新疆農業大學動物醫學學院試驗基地飼養的成年雄性新疆細毛羊，飼糧為精飼料和苜蓿，自由飲水，并經獸醫健康認定無抗生素使用史。無特定病原體(SPF)級雄性昆明小鼠，共20只，體重(26±2)g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，自由采食和飲水。
1.1.2主要試劑及供試菌株
LB肉湯及瓊脂培養基、HBI芽孢桿菌生化鑒定條購自青島海博生物技術有限公司;脫纖維綿羊血、牛膽鹽購自北京索萊寶科技有限公司;細菌藥敏紙片(批號:20172400206)為杭州濱和微生物試劑有限公司產品;牛源大腸桿菌K99、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌菌株為新疆農業大學動物醫學學院臨床產科實驗室保存菌株。
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