HIF-1α納米抗體對黑素瘤細(xì)胞增殖與生長（摘要、試驗(yàn)方法）
氧是生命活動(dòng)中所必需的物質(zhì)，且在其中起重要作用[1]。缺氧在惡性腫瘤中是較為常見的，且缺氧還是腫瘤生長環(huán)境最顯著的特征之一[2]。組織和細(xì)胞是通過缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor，HIF）誘導(dǎo)相應(yīng)靶基因來適應(yīng)氧氣濃度[3]。HIF-1、HIF-2及HIF-3是HIF的3種亞型，均由氧調(diào)節(jié)型α亞基和組成型β亞基構(gòu)成，α亞基是活性亞基，又分為HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α[4]。HIF-1α與氧濃度的關(guān)系密切，HIF-1α是缺氧細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵，其穩(wěn)定性和活性受各種翻譯后修飾、羥基化、乙酰化和磷酸化的調(diào)節(jié)[5]。HIF-1α成為許多適應(yīng)低氧微環(huán)境疾病的主要參與者，如癌癥、中風(fēng)和心臟病[6]。因此，阻斷HIF-1α的表達(dá)或阻斷其相互作用的蛋白質(zhì)會(huì)抑制腫瘤生長[7]。HIF-1α在腫瘤組織中表達(dá)增高，一方面與腫瘤組織增生過快造成局部組織缺氧有關(guān)，另一方面，HIF-1α是多種依賴氧張力的調(diào)節(jié)因子[8]，與某些癌基因激活或抑癌基因失活有關(guān)。因此，HIF-1α的表達(dá)量可作為檢測惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)。
黑色素瘤來源于黑色素細(xì)胞，是一種具有侵襲性的皮膚癌[9-10]。黑色素瘤雖然發(fā)病率不高，但其死亡率較高[11-12]。黑色素瘤多發(fā)于哺乳動(dòng)物皮膚和黏膜，均具有侵襲性和致死性，且預(yù)后差[13-14]。HIF-1α的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究其在黑色素瘤發(fā)病和發(fā)展機(jī)制中的作用對于改善患者的臨床結(jié)果至關(guān)重要[15]。HIF-1α介導(dǎo)不同過程的基因轉(zhuǎn)錄，包括應(yīng)激適應(yīng)、代謝、凋亡、腫瘤生長、血管生成和侵襲[16]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α參與了PI3K/Akt/mTOR、Ras/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT、Wnt/β-catenin、Notch等信號通路[17-18]，這些路徑及其相關(guān)的復(fù)雜變化影響黑色素瘤的生長和發(fā)展、新陳代謝、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞凋亡[19]。
傳統(tǒng)抗體藥物分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，較易失活且價(jià)格昂貴。納米抗體的優(yōu)勢在于分子小、滲透性強(qiáng)，能夠針對傳統(tǒng)單抗所不能觸及的抗原表位設(shè)計(jì)藥物，使其更好地到達(dá)腫瘤內(nèi)部以及穿透血腦屏障[20]。因此，基于HIF-1α表達(dá)受到抑制將發(fā)揮抗腫瘤功能，結(jié)合納米抗體的優(yōu)勢，本研究以羊駝源黑色素瘤B16噬菌體文庫制備HIF-1α納米抗體，并驗(yàn)證其在黑素瘤的生長和發(fā)展過程中的作用，旨在為抑制腫瘤生長提供新思路。
1材料和方法
1.1試驗(yàn)材料
大腸桿菌TG1、輔助噬菌體M13K07、B16細(xì)胞和羊駝源黑色素瘤B16噬菌體文庫、正常小鼠腦組織切片均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室保存提供。HIF-1α多肽購自武漢三鷹生物科技有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1 HIF-1α納米抗體的篩選將HIF-1α多肽稀釋至終質(zhì)量濃度為20μg/mL，包被免疫管，4℃靜置過夜，以備用。將TG1接種于5 mL 2YT培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)以活化。
將500μL噬菌體文庫溶于100 mL 2YT/AG溶液培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600nm值為0.4～0.6；加入100μL輔助噬菌體，混勻靜置30 min，再37℃、200 r/min振蕩30 min，棄上清，加入100 mL 2YT/AK液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至過夜。次日，將TG1接入30 mL 2YT中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至D600nm=0.4備用。4℃、11 000 r/min離心10 min，去上清加入1/5體積遇冷的PEG/NaCl，冰上放置70 min。離心后用2.4 mL無菌PBS重新懸浮菌體沉淀，再次離心，回收上清加入事先包被20μL/mLHIF-1α多肽的免疫包被管中。37℃封閉1 h后用PBS沖洗，并加入三乙醇胺，緩慢振蕩15 min，加入Tris-HCl中和。將其涂布于2YT/AG平板，30℃培養(yǎng)過夜。次日收集菌落，作為HIF-1α一級文庫。
按上述方法，分別以10、5、2.5μg/mL的HIF-1α質(zhì)量濃度進(jìn)行第2輪、3輪、4輪的淘篩。從第4輪篩選洗脫物滴定的平板上，隨機(jī)挑取96個(gè)單克隆接種于2YTAG中與30℃振蕩培養(yǎng)8 h，加入稀釋的噬菌體，37℃振蕩培養(yǎng)1 h后離心，棄去上清用含有Kana抗性的培養(yǎng)基重懸沉淀，37℃過夜培養(yǎng)。
將HIF-1α蛋白和BSA蛋白包被于96孔板，用ELISA法篩選陽性克隆并進(jìn)行測序，比對測序結(jié)果，在NCBI基因庫中選擇VHH序列并用DNAMAN進(jìn)行比對和ORF Finder軟件進(jìn)行氨基酸序列分析，選取能夠完整表達(dá)蛋白質(zhì)的菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
1.2.2載體的構(gòu)建按陽性克隆的DNA序列設(shè)計(jì)引物（含BamHI、SalI酶切位點(diǎn)）：HIF-1α-F：5'-CGGGATCCGAGTCGGGAGGAGGCTTGG-3'；HIF-1α-R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGGT GACTAGGG-3'。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50μL：2×Es Taq Master Mix 25μL，上下游引物各2μL，模板5μL，ddH2O補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。
PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳膠回收，將回收產(chǎn)物和PMD19-T連接，PMD-19T反應(yīng)體系為：PMD-19T 1μL，回收產(chǎn)物4μL，Solution Buffer 1μL。之后再以BamHI、SalI將19TNbHIF-1α和pET-28a進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行T4連接（雙酶切體系為：10×QuickCut Buffer 5μL，BamHⅠ1μL，SalⅠ1μL，19TNbHIF-1α質(zhì)粒8μL，ddH2O 35μL；T4連接體系為：回收菌體質(zhì)粒6μL，回收載體2μL，T4連接酶1μL，T4Buffer 2μL，ddH2O 9μL，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，涂布于含100μg/mL Kana的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB-Kana液體培養(yǎng)基搖至D600為0.4～0.6后測序，將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pET28a-NbHIF-1α。
1.2.3 HIF-1α納米抗體表達(dá)與純化將5μL pET28a-NbHIF-1α提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中，冰浴30 min，42℃熱激45 s，再冰浴3 min，37℃、200 r/min振蕩活化1 h，菌液接種于LBKana液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩至D600為0.6，加入0.3 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），28℃、200 r/min搖菌4 h后收菌，將菌液沉淀用PBS清洗2次后超聲破碎，16 000 g離心30 min。使用AKTA層析系統(tǒng)與鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）預(yù)裝柱對帶有His標(biāo)簽的納米抗體進(jìn)行純化，分別用不同梯度咪唑和分子篩除去雜蛋白，將蛋白用超濾管濃縮后分裝，-80℃保存。
1.2.4 HIF-1α納米抗體的應(yīng)用將6周齡正常小鼠腦組織研磨后提取總蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將純化的HIF-1α納米抗體作為一抗、HRPHis-Tag作為二抗進(jìn)行Western Blot檢測腦組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)。
將制備的小鼠腦組織制備石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)，然后在3%雙氧水中室溫孵育30 min。用PBS洗滌后，用5%BSA在37℃封閉1 h，然后與純化的納米抗體或PBS（空白對照）孵育，之后于37℃在His-tag抗體孵育1 h。DAB顯色，隨時(shí)觀察停止顯色，然后用蘇木精復(fù)染，脫色封片，檢測小鼠腦組織中HIF-1α表達(dá)分布。
1.2.5 HIF-1α納米抗體對黑素瘤細(xì)胞增殖的影響待B16細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長到80%～90%，與HIF-1α納米抗體加入96孔板中，并保證每孔2 000個(gè)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中待6 h后，在每孔中加入10μL CCK-8工作液，檢測0、3、6、9 h的450 nm波長的吸光度。
1.2.6 HIF-1α納米抗體對黑素瘤細(xì)胞遷移的影響將培養(yǎng)到80%～90%的B16細(xì)胞傳代至12孔板中，待細(xì)胞長滿12孔板后，使用直尺與100μL槍頭在12孔板劃平行線，用PBS緩沖液洗凈殘留細(xì)胞。試驗(yàn)組加入HIF-1α納米抗體。分別在劃痕0、12、24、36 h后對同一位置進(jìn)行拍照，觀察細(xì)胞遷移結(jié)果。
1.2.7 HIF-1α納米抗體對增值相關(guān)蛋白表達(dá)的影響選取培養(yǎng)狀態(tài)良好且培養(yǎng)到80%～90%的豐度，細(xì)胞傳代到6孔板中，試驗(yàn)組和對照組各3個(gè)孔。試驗(yàn)組中加入HIF-1α抗體，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。用所提蛋白進(jìn)行Westen Blot檢測，以β-actin為內(nèi)參，檢測細(xì)胞中Ras、RAF1、ERK1/2、RAC1和VEGF蛋白表達(dá)量。
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