焦化污染場地中萘降解菌株AO-4鑒定、生長、降解機(jī)理及環(huán)境條件帶來的影響（三）
2結(jié)果與討論
2.1萘降解菌的篩選及鑒定
通過增加環(huán)境選擇的壓力，逐步提高萘的濃度對(duì)菌種進(jìn)行馴化、篩選，分離到一株萘的高效降解菌株AO-4。菌株在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長良好，驗(yàn)證了其以萘作為唯一碳源生長的能力，表明其可用于含萘污染物的生物修復(fù)。
AO-4菌株在含萘的MSM固體培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，扁平狀，邊緣不整齊，大小不一，平均直徑約為2.0～3.0mm[圖1(a)]。顯微鏡下可見菌體為桿菌，長約1.5～3.0μm，寬約0.5～0.8μm，革蘭氏染色后呈紅色，為革蘭氏陰性細(xì)菌[圖1(b)]。桿狀細(xì)菌在污染物的微生物降解中非常常見，因?yàn)樵诟患囵B(yǎng)過程中，桿菌比球菌能更好地適應(yīng)環(huán)境，可高效利用一些致密顆粒（如PAHs），比球菌分裂更快而成為優(yōu)勢(shì)菌群。
圖1菌株AO-4的菌落形態(tài)(a)及革蘭氏染色后細(xì)胞形態(tài)(b)
通過16S rDNA測(cè)序及Genbank數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株AO-4與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的同源性最高，序列相似度達(dá)到99.9%。采用鄰域連接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），顯示菌株AO-4與多株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有高度同源性。已有眾多研究證明，銅綠假單胞菌對(duì)多種PAHs具有較強(qiáng)的降解能力，如Patowary等發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在35℃和pH=7條件下，對(duì)0.3%的萘降解率可達(dá)89.2%。
圖2基于菌株AO-4的16S rDNA基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
綜上，依據(jù)菌株AO-4的形態(tài)特征以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株AO-4鑒定為銅綠假單胞菌，此菌株16S rDNA序列已提交到國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（DOI：http://dx.doi.org/10.12210/sequence.NMDCN00011F3）。
2.2萘降解途徑關(guān)鍵酶的基因檢測(cè)
假單胞菌對(duì)萘的降解通常是通過水楊酸途徑完成的。萘經(jīng)萘雙加氧酶催化開環(huán)形成順-萘雙氫二醇后，在脫氫酶的催化下形成1，2-二羥基萘，再經(jīng)過一系列反應(yīng)生成水楊醛，隨后經(jīng)水楊醛脫氫酶作用形成水楊酸，水楊酸在水楊酸羥化酶催化下形成鄰苯二酚，通過鄰苯二酚2，3-雙加氧酶開環(huán)后被轉(zhuǎn)化為乙醛和丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終被降解為H2O和CO2。
選取了萘經(jīng)水楊酸代謝途徑降解的關(guān)鍵酶基因：萘雙加氧酶的鐵硫蛋白大亞基（nahAC）、水楊醛脫氫酶（nahF）、水楊酸羥化酶（nahG）和鄰苯二酚2，3-雙加氧酶（nahH）分析菌株對(duì)萘可能的降解途徑。以菌株AO-4染色體為模板進(jìn)行上述四種基因的特異性擴(kuò)增，凝膠電泳圖（圖3）上可見nahAC和nahH在750～1000bp位置均出現(xiàn)明顯條帶，與文獻(xiàn)中假單胞菌的nahAC（1009bp）、nahH（923bp）基因大小基本一致，可基本判斷AO-4的基因組中含有nahAC、nahH兩個(gè)基因。在AO-4的基因組中未檢測(cè)到基因nahF和nahG，一方面這可能是由于該菌株對(duì)污染物萘的降解有別于已知的降解途徑；另一方面有研究表明，PAHs的部分降解基因位于菌株的質(zhì)粒上，此處未對(duì)菌株的質(zhì)粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增，這可能是nahF和nahG這兩個(gè)基因未被檢出的原因。
圖3萘降解途徑中的部分關(guān)鍵酶基因nahG、nahF、nahAC和nahH的PCR擴(kuò)增結(jié)果
先前研究表明所有的萘降解菌都含有nahAC基因，通過對(duì)萘降解途徑中的關(guān)鍵酶基因（nahAC、nahH、nahF和nahG等）進(jìn)行檢測(cè)，可以初步篩選萘降解菌株、判斷菌株的萘降解途徑，但對(duì)降解途徑的進(jìn)一步探究還需對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
2.3菌株AO-4對(duì)萘的降解性能
研究考察了菌株AO-4在液體中對(duì)萘的降解能力，萘濃度為菌株馴化的最高濃度400mg/L，體系的pH為7.0，接種菌量為2%（體積分?jǐn)?shù)）。在降解過程中監(jiān)測(cè)了菌株AO-4的生長曲線、萘的降解率和菌體脫氫酶活性隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖4所示。
圖4菌株AO-4對(duì)萘的降解特性
從菌株生長曲線[圖4(a)]可以發(fā)現(xiàn)，菌體濃度隨時(shí)間變化逐漸增大，在24h OD600達(dá)到0.325后增長速度減緩，菌株生長經(jīng)歷了適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期后將進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株AO-4在以萘為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)液的生長再次驗(yàn)證了菌株AO-4代謝萘的能力。
菌株AO-4對(duì)萘的降解率[圖4(b)]在反應(yīng)開始的8h內(nèi)略有增長，在8～24h之間400mg/L的萘近乎被完全降解，24h時(shí)萘的降解率達(dá)到97.67%，48h降解完全。這與菌株生長曲線變化趨勢(shì)相近，8～24h期間，菌株迅速生長，降解率快速攀升；24h后菌株處于穩(wěn)定期，代謝過程緩慢。在研究玫瑰色紅球菌對(duì)芘降解特性時(shí)，也有類似現(xiàn)象，菌株在8d降解率達(dá)到47%后，8～16d時(shí)菌株處于穩(wěn)定期或衰亡期，降解率無明顯變化。
脫氫酶活性[圖4(c)]在前8h升高比較緩慢，8～24h迅速升高，在24h后仍有緩慢增長的趨勢(shì)。PAHs的降解是基于PAHs的氧化，降解過程中脫氫酶可以使PAHs的氫原子活化并轉(zhuǎn)移至特定的受氫體，使PAHs被氧化。脫氫酶活性可在一定程度上反應(yīng)微生物對(duì)有機(jī)污染物的氧化降解能力。以上結(jié)果表明菌株AO-4可有效利用400mg/L萘作為碳源生長，菌體的脫氫酶活性，菌株生長情況與萘的降解率表現(xiàn)出正相關(guān)。
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